TNFAIP1與RIN3相互作用的鑒定

賀瓊芝，李 莉，顏 峰，李 文，魏 科，劉慶文，張 健，胡 翔

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國 長沙 410081)

腫瘤壞死因子相互作用蛋白TNFAIP1，又名B12，是Hua He等2001年以DNA 聚合酶δ的小亞基p50為靶基因通過酵母雙雜交篩選得到的相互作用蛋白[1]．其編碼基因定位于人類染色體17q22-q23，編碼一個(gè)由985個(gè)氨基酸殘基組成的相對(duì)分子質(zhì)量為1.08×105的蛋白．TNFAIP1與KCTD10,PDIP1同屬于PDIP1基因家族，其結(jié)構(gòu)高度保守，N段有BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和鉀離子通道四聚體結(jié)構(gòu)域，C端具有PCNA(Proliferating cell nuclear antigen，增殖細(xì)胞核抗原)結(jié)合結(jié)構(gòu)域[2]．在TNFAIP1 N端含有鉀離子通道四聚體結(jié)構(gòu)域，說明其可能調(diào)控鉀離子通道的選擇與通透性．TNFAIP1能被腫瘤壞死因子TNF-α和IL-6 (interleukin 6，白介素6)誘導(dǎo)，且能與PCNA相互作用，可推測TNFAIP1在細(xì)胞因子激活和DNA復(fù)制中有重要作用[1]．在老年癡呆癥線蟲模型中TNFAIP1在低致病部位有高表達(dá)[3]，且在阿爾海默氏癥AD病人死后大腦中檢測到了TNFAIP1的異常表達(dá)[3]，這說明TNFAIP1可能在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和發(fā)展過程中有非常重要作用．TNFAIP1還可能參與肝臟損傷與修復(fù)[4]．這些都說明TNFAIP1是一個(gè)多功能蛋白，參與細(xì)胞生長、病變、疾病發(fā)生．但是目前對(duì)其功能和機(jī)制具體而確切的研究尚少，所以作者通過酵母雙雜交系統(tǒng)，以TNFAIP1為靶基因篩選與其相互作用蛋白．作者篩選到7個(gè)陽性克隆，其中3個(gè)經(jīng)測序?yàn)镽IN3，4個(gè)為同屬于PDIP1基因家族的KCTD10．RIN3屬于RIN家族，其家族可能參與細(xì)胞的胞吞胞吐．RIN3作為刺激因子，穩(wěn)定GTP-Rab5，在質(zhì)膜到內(nèi)小體的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中發(fā)揮重要作用[5]．作者通過免疫共沉淀，熒光共定位證明TNFAIP1蛋白能直接與RIN3相互作用，由此推測TNFAIP1可能參與細(xì)胞的胞吞與胞吐．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

美國Invitrogen公司的酵母雙雜交系統(tǒng)及文庫；Amersham Pharmacia Biotech公司的Glutathione-Sepharose 及Nickel-nitrilotriacetic珠子；Takara公司的載體pGEX-4T-2,pCMV-Myc,pCMV-HA和pEGFP-C3；sigma公司的Myc多克隆抗體、HA單克隆抗體；SantaCruz公司的Myc單克隆抗體，Protein A/G；KPL公司的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG；Millipore公司的PVDF膜；pierce公司的ECL顯色試劑盒；限制性內(nèi)切酶等工具酶購自takara公司；HeLa細(xì)胞系，PDBLeu-TNFAIP1質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室保存．

1.2 方法

1.2.1 酵母雙雜交系統(tǒng)及篩選 作者采用GIBCO ProQuest酵母雙雜交系統(tǒng)，以PDBLeu-TNFAIP1為靶質(zhì)粒篩選人胚胎腦文庫．首先制備宿主菌Mav203感受態(tài)，將PDBLeu-TNFAIP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌Mav203中，再將人胚胎腦文庫質(zhì)粒用鮭精DNA轉(zhuǎn)入含有質(zhì)粒PDBLeu-TNFAIP1的酵母菌Mav203中．文庫轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物全部涂于SC-Leu-Trp-Ura-His+3AT(25 mmol/L)的篩選平板，將涂好的平板置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)大約1周，可出現(xiàn)陽性菌落，選取這種初步斷定的陽性菌落進(jìn)行報(bào)告基因LacZ的藍(lán)斑試驗(yàn)：將初步判斷為陽性的菌落以及系統(tǒng)的陽性對(duì)照菌C、D和陰性對(duì)照菌接種于放置在YPAD平板上的尼龍膜，在膜上作好標(biāo)記．30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，在一個(gè)滅菌的15 cm培養(yǎng)皿上鋪兩張X-gal溶液浸潤的濾紙，除去氣泡．用鑷子將長好菌的尼龍膜取下，在液氮和室溫下凍融2次將膜覆蓋在濾紙上，有菌的那一面朝上．加蓋置于37 ℃，觀察結(jié)果[6]．

1.2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)RIN3的結(jié)構(gòu)域，做缺失突變：RIN3N(0～1 680)，RIN3C(1 685～2 955)．以人胚胎腦文庫為模板，分段引物RIN3FL PF：5′-ATG GAA TTC GCA TGA TCC GAC ACG CCG-3′和PR：5′-TGG GGT ACC TCA CAG GAA GTT GGG CTC-3′； RIN3-N PF: 5′-ATG GAA TTC GCA TGA TCC GAC ACG CCG-3′和PR：5′-ATT GGT ACC TCC TCC GTG CTG CTG GTG-3′；RIN3-C PF：5′-ATG GAA TTC TGG AGC AGT TCA GCA GCC-3′和PR：5′-TGG GGT ACC TCA CAG GAA GTT GGG CTC-3′，在EXtaq酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到RIN3的編碼DNA片段，連入EcoR1和Kpn1雙酶切的pCMV-HA，pEGFP-C3的質(zhì)粒載體中，得到質(zhì)粒pCMV-HA-RIN3FL, pCMV-HA-RIN3N, pCMV-HA-RIN3C和pEGFP-C3-RIN3FL, pEGFP-C3-RIN3N, pEGFP-C3-RIN3C．

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀分析 在37 ℃條件下，在5%的CO2培養(yǎng)箱中用DMEM完全培養(yǎng)液(補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為10%的新生牛血清、2 mmol/L谷氨酸和100 mmol·min-1·L-1青霉素)培養(yǎng)HeLa 細(xì)胞． 當(dāng)細(xì)胞生長到80%～90%時(shí), 分別將8 μg pCMV-HA-RIN3FL、pCMV-HA-RIN3N、pCMV-HA-RIN3C與8 μg pCMV-Myc-TNFAIP1用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞．繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后，用1×PBS洗細(xì)胞，用細(xì)胞刮將細(xì)胞收獲到1.5 mL的離心管中，500 g離心3 min，吸去PBS，加入600 μL RIPA (含50 mmol/L pH 7. 2 的Tris、150 mmol/L NaCl 、體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X2100、體積分?jǐn)?shù)為1%的脫氧膽酸鈉鹽、體積分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS 和1 mmol/L PMSF)裂解，超聲破碎細(xì)胞，12 000 g離心20 min，取上清．每10 cm皿細(xì)胞裂解液一管做Input，不加入抗體．另外一管細(xì)胞裂解液分別加入Myc多抗室溫反應(yīng)4 h．取40 μL ProteinA/G，用RIPA活化：離心去上清，加入1 mL RIPA，4 ℃搖5 min，500 g離心3 min，去上清．如此反復(fù)3次．將ProteinA/G平均加到已經(jīng)加入抗體的兩管裂解液中，4 ℃搖4 h，或4 ℃過夜．500 g離心去上清．加入1 mL RIPA，4 ℃搖4 h，500 g離心3 min，棄上清．如此反復(fù)3次．加入30 μL RIPA，再加入6 μL 6×上樣緩沖液，取50 μg Input，加入6×上樣緩沖液，一起105 ℃變性10 min，12 000 g離心15 min．進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，通過Western 雜交的方法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)于硝酸纖維膜,用抗Myc和HA的抗體檢測．

1.2.4 真核細(xì)胞內(nèi)的熒光定位 細(xì)胞培養(yǎng)方法見1.2.3，在12孔細(xì)胞培養(yǎng)皿底部放置無菌的蓋玻片培養(yǎng)HeLa細(xì)胞至70%匯集．分別將1μg pEGFP-RIN3FL、pEGFP-RIN3N、pEGFP-RIN3C與1μg pERFP-TNFAIP1用脂質(zhì)體Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞．吸去培養(yǎng)液，用1 mL PBS洗一次，體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛室溫固定10 min．用PBS洗兩次，每次5 min．加入體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮/甲醇，脫水30 s．用PBS洗4次，每次5 min．加入Hoechst 33258染核(用PBS按1∶1 000稀釋)30 min．PBS洗3次，每次5 min．把蓋玻片正面朝上置于載玻片上，于熒光顯微鏡Zeiss Axioskop 2下觀察．

2 結(jié)果與分析

1表示陰性對(duì)照；2和3表示系統(tǒng)所帶陽性對(duì)照；4～6為陽性克??；7～8為陰性克隆圖1 TNFAIP1酵母雙雜交藍(lán)斑實(shí)驗(yàn)

2.1 酵母雙雜交篩選文庫獲得TNFAIP1相互作用基因RIN3

將經(jīng)SC-Leu-Trp-Ura-His+3AT(25mmol/L)營養(yǎng)缺陷平板篩選初步確定為陽性的酵母菌落重新涂一次SC-Leu-Trp-Ura-His+3AT(25mmol/L)營養(yǎng)缺陷平板．長出來的陽性菌落進(jìn)行進(jìn)一步的藍(lán)斑實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示：1號(hào)位置為陰性對(duì)照，2、3號(hào)位置為系統(tǒng)所帶陽性對(duì)照，4～6號(hào)位置為初步確定為陽性的克隆，其中的6號(hào)為RIN3基因，7～8號(hào)位置為陰性克隆，作者一共獲得7個(gè)陽性克隆，其中3個(gè)為RIN3基因．

2.2 成功構(gòu)建RIN3的缺失突變體

根據(jù)RIN3的結(jié)構(gòu)域，把RIN3分為RIN3N和RIN3C兩段(圖2)．分別設(shè)計(jì)引物，5′端帶EcoR1酶切位點(diǎn)，3′端帶Kpn1酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增分別得到所需條帶．將質(zhì)粒插入EcoR1和Kpn1雙酶切的pCMV-HA載體中．非常規(guī)轉(zhuǎn)化DH5α，小量制備提取質(zhì)粒．將質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測序，測序結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功．驗(yàn)證正確(圖3)．中量制備擴(kuò)增質(zhì)粒．

圖2 RIN3分段結(jié)構(gòu)域 圖3 RIN3分段質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證圖

PCMV-Myc-RIN3FL、RIN3N和RIN3C分別經(jīng)EcoR1和Kpn1雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到3 000 bp、1 600 bp和1 400 bp左右的條帶，酶切驗(yàn)證正確．

2.3 免疫共沉淀分析

pCMV-Myc-TNFAIP1為實(shí)驗(yàn)室保存．在HeLa細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染pCMV-HA，pCMV-HA-RIN3及其突變質(zhì)粒和pCMV-Myc-TNFAIP1質(zhì)粒．pCMV-HA為實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照．其中pCMV-HA-RIN3FL蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為1.08×105,pCMV-HA-RIN3N蛋白為6.1×104,pCMV-HA-RIN3C蛋白為4.7×104．進(jìn)行免疫共沉淀分析，用Myc多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，用HA單克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測．如圖4所示，RIN3FL較長，表達(dá)比較弱，但是仍然檢測出了RIN3FL的帶，所以RIN3能與TNFAIP1相互作用．RIN3N泳道比RIN3C泳道帶強(qiáng)，說明RIN3N端與TNFAIP1作用較C端強(qiáng)．

從左至右，泳道1，陰性對(duì)照；泳道2～4，TNFAIP1可以分別與RIN3FL、RIN3N和RIN3C相互作用圖4 免疫共沉淀分析(CO-IP)

2.4 細(xì)胞熒光共定位分析

pERFP-TNFAIP1為實(shí)驗(yàn)室保存．同時(shí)把連入pCMV-HA載體中的RIN3片段，連入pEGFP-C3載體中．在HeLa細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-RIN3及其突變質(zhì)粒和pERFP-TNFAIP1質(zhì)粒，進(jìn)行細(xì)胞熒光定位實(shí)驗(yàn)．發(fā)現(xiàn)RIN3FL與TNFAIP1共定位在細(xì)胞質(zhì)中(圖5)．RIN3N端也與TNFAIP1在細(xì)胞質(zhì)中共定位．RIN3C端與TNFAIP1在細(xì)胞質(zhì)中點(diǎn)狀共定位．這與作者前面的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致．

從上至下分別為RIN3FL、RIN3N和RIN3C與TNFAIP1在細(xì)胞質(zhì)中共定位．圖5 RIN3與TNFAIP1在HeLa細(xì)胞中熒光共定位

3 討論

目前國際上對(duì)于TNFAIP1基因確切的功能和機(jī)制研究還處于初期階段．TNFAIP1能受TNF-α和IL-6誘導(dǎo),并能與PCNA及DNA聚合酶δ亞單位直接相互作用[1]．TNFAIP1在癌細(xì)胞系中低表達(dá)，并且在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)TNFAIP1能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[7-8]．TNFAIP1可能在老年癡呆癥的發(fā)展和肝臟損傷后的修復(fù)過程中起重要的保護(hù)作用[3]．這些實(shí)驗(yàn)說明TNFAIP 1在細(xì)胞生長、凋亡和人類疾病中可能起到重要作用．

Smith TC等以Supervillin為靶蛋白，用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了與其相互作用的蛋白TNFAIP1．Supervillin是一個(gè)外在膜蛋白，調(diào)控細(xì)胞遷移[9]．而RIN3能與細(xì)胞膜開關(guān)蛋白R(shí)ab5相互作用，參與細(xì)胞早期胞吞途徑．RIN3作為Rab5的刺激因子和活化狀態(tài)穩(wěn)定劑，介導(dǎo)質(zhì)膜到早期內(nèi)小體的運(yùn)輸，在膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中有重要作用[5]．日本學(xué)者M(jìn)anabu Yoshikawa發(fā)現(xiàn)在酪氨酸磷酸化信號(hào)途徑中，RIN3被轉(zhuǎn)運(yùn)至早期的細(xì)胞內(nèi)小泡[10]．這些都充分說明TNFAIP1和RIN3的相互作用可能參與了細(xì)胞的胞吞胞吐途徑，但其具體的過程及其機(jī)制需進(jìn)一步研究．

參考文獻(xiàn)：

[1] HE H, TAN C K, DOWNEY K M. A tumor necrosis factor alpha—and interleukin 6-inducible protein that interacts with the small subunit of DNA polymerase delta and proliferating cell nuclear antigen [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98:11 979-11 984.

[2] 李 紅，賀志成，劉 倩,等.誘導(dǎo)表達(dá)tnfaip1的穩(wěn)定細(xì)胞系 [J]. 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 2008,31(2):96-99.

[3] LINK C D, TAFT A, KAPULKIN V,etal. Expression analysis in a transgenic caenorhabditis elegans alzheimer’s disease model [J]. Neurobiol Aging, 2003, 24:397-413.

[4] 熊熙文, 劉 鑫,胡小曉，等. B12基因在小鼠部分肝切除后的表達(dá)差異分析 [J]. 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 2004,27(1):71-74.

[5] KAJIHO H, SAITO K, TSUJITA K,etal. RIN3: a novel Rab5 GEF interacting with amphiphysin II involved in the early endocytic pathway [J]. J Cell Sci, 2003, 116:4 159-4 168.

[6] 鐘英麗, 劉云海,胡 翔,等. 用酵母雙雜交篩選與ap-2α相互作用的因子 [J]. 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 2003,26(3):73-77 .

[7] 孫振華,賀瓊芝,顏 峰,等. TNFAIP1基因通過抑制Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 [J]. 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 2009,32(1):112-115.

[8] 楊利平,周愛冬,李 紅,等.人tnfaip1基因在常見細(xì)胞系中的表達(dá) [J]. 遺傳, 2006, 28(8):918-922.

[9] SMITH T C, FANG Z, LUNA E J,etal. Novel interactors and a role for supervillin in early cytokinesis [J]. Cytoskeleton (Hoboken), 2010, 67:346-64.

[10] YOSHIKAWA M, KAJIHO H, SAKURAI K,etal. Tyr-phosphorylation signals translocate RIN3, the small GTPase Rab5-GEF, to early endocytic vesicles [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008,372:168-72.