碳納米管/聚酰胺-胺復(fù)合物的原位合成及BSA固載性能

陳 瓊，張寶玲，唐 浩

(湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點實驗室，中國 長沙 410081)

采用合適的方法對碳納米管(CNTs)進(jìn)行均一、可控的表面功能化修飾，以實現(xiàn)生物大分子高效固定，對于拓寬CNTs在生物傳感器、基因/蛋白質(zhì)治療等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要的研究意義．聚酰胺-胺枝狀高分子(PAMAM)具有較多的分枝、精確的球狀結(jié)構(gòu)和外圍密集的官能團(tuán)，在超分子自組裝、催化合成、藥物/基因載體系統(tǒng)等方面顯示出誘人的應(yīng)用前景[1-6].通過“graft from”方法合成CNTs-PAMAM復(fù)合物已有報道[7-9]．然而，有關(guān)Michael加成和酰胺化反應(yīng)級數(shù)對多壁碳納米管(MWCNTs)-PAMAM復(fù)合物的微觀形貌和外圍官能團(tuán)的影響及該復(fù)合物在蛋白質(zhì)固定方面的應(yīng)用還未見報道．本文作者通過原位交替Michael加成和酰胺化反應(yīng)制備了MWCNT-PAMAM復(fù)合物，并對其微觀形貌、表面官能團(tuán)和蛋白質(zhì)固載性能與反應(yīng)級數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行了研究．

1 實驗部分

1.1 試劑和材料

W(MWCNTs)(購自深圳納米港股份有限公司)>95 %，長度5～15 μm，直徑10～20 nm．1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亞胺(EDC·HCl)購自Merck．BSA購自Roche有限公司．乙二胺(EDA)和丙烯酸甲酯(MA)購自長沙安泰精細(xì)化工廠．其他所有試劑均為分析純或以上．所有溶液均用Millipore超純水(>1.8×107Ω·cm)現(xiàn)配．

1.2 MWCNT-PAMAM復(fù)合物的制備及BSA的固定

MA:丙烯酸甲酯； EDA:乙二胺圖1 MWCNT-PAMAM復(fù)合物制備及BSA的固定示意圖

通過原位“graft from”方法[10]制備MWCNT-PAMAM復(fù)合物．實驗原理如圖1所示：首先制備乙二胺(EDA)修飾的MWCNTs(MWCNT-NH2)作為起始核，通過交替的(a)、(b)反應(yīng)合成MWCNT-PAMAM復(fù)合物：

完成(a)、(b)反應(yīng)獲得的MWCNT-PAMAM復(fù)合物表面端基為氨基；若在步驟(a)終止反應(yīng)，則表面端基為酯基．通過控制(a)、(b)反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)(反應(yīng)級數(shù))，可制得具有不同尺寸、不同表面端基的MWCNT-PAMAM復(fù)合物．

具體實驗步驟如下：將一定質(zhì)量的MWCNTs在濃鹽酸中80 ℃回流12 h，經(jīng)抽濾、超純水清洗、50 ℃下干燥24 h得純化的MWCNTs．純化的MWCNTs于V(濃硫酸)∶V(濃硝酸)=3∶1的混酸中，80 ℃回流24 h，產(chǎn)物經(jīng)抽濾、清洗、干燥得羧基化的MWCNTs(MWCNT-COOH)．以EDC為脫水劑，EDA通過酰胺化反應(yīng)修飾至MWCNTs的表面．具體操作如下：20.0 mg MWCNT-COOH、20.0 mg EDC加入20 mL EDA中，超聲分散10 min．混合物在25 ℃下反應(yīng)24 h，產(chǎn)物經(jīng)抽濾、無水酒精清洗(至少10次)、60 ℃干燥48 h，得MWCNT-NH2．MWCNT-PAMAM復(fù)合物制備具體操作如下：Michael加成、酰胺化反應(yīng)均在甲醇溶劑中進(jìn)行．將40 mg MWCNT-NH2加入10 mL N2-飽和的甲醇中，冰鹽浴(41 g CaCl2·6H2O + 100 g 碎冰，-5 ～ -10 ℃)中攪拌30 min；然后攪拌下逐滴加入10 mL MA．混合物攪拌、避光下室溫反應(yīng)24 h．未反應(yīng)的試劑和溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除．所得產(chǎn)物標(biāo)記為MWCNT-G0.5(反應(yīng)(a)完成，反應(yīng)級數(shù)為0.5)；此產(chǎn)物50 ℃下干燥24 h．將30.0 mg MWCNT-G0.5分散至10 mL N2-飽和的甲醇中，攪拌30 min后滴加(120滴/min)至N2-飽和的30 mL EDA + 15 mL甲醇溶液中，攪拌、避光下反應(yīng)36 h(-5 ～ -10 ℃，冰鹽浴控制)．未反應(yīng)的試劑和溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除．所得產(chǎn)物標(biāo)記為MWCNT-G1.0(反應(yīng)(a)、(b)完成，反應(yīng)級數(shù)為1.0)；此產(chǎn)物50 ℃下干燥24 h．其他MWCNT-PAMAM復(fù)合物(MWCNT-G2.0，MWCNT-G3.0和MWCNT-G4.0)制備方法與MWCNT-G1.0的相似．但隨著反應(yīng)級數(shù)增加，反應(yīng)時間需延長；且MA、EDA過量[10]．

BSA在MWCNT-PAMAM復(fù)合物表面的固定在水溶液(pH 6.5)中利用靜電吸附作用完成．在此pH條件下，MWCNT-PAMAM復(fù)合物外表面氨基被質(zhì)子化從而帶正電；而BSA在pH值高于其等電點時帶負(fù)電(BSA等電點約為4.7)．因此，當(dāng)二者混合時，BSA可通過靜電作用固定至MWCNT-PAMAM復(fù)合物表面．具體實驗操作如下：將10 μL 2 mg·mL-1BSA水溶液加入490 μL 0.5 g·L-1超聲分散的MWCNT-PAMAM水分散液中，攪拌下室溫反應(yīng)2 h；經(jīng)離心分離(10 000 r/min)、超純水清洗，產(chǎn)物分散至500 μL超純水中制成MWCNT-PAMAM-BSA水分散液．

1.3 儀器和測量方法

以透射電子顯微鏡(TEM，JOEL 1230，加速電壓100 kV)、尼科萊Nexus 670紅外光譜儀(尼科萊儀器有限公司)、UV-2450紫外-可見光譜(島津，日本)表征MWCNT-PAMAM、MWCNT-PAMAM-BSA復(fù)合物微觀形貌、表面官能團(tuán)．

CHI 660A電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，三電極體系：工作電極為MWCNT-PAMAM修飾電極(基底為玻璃碳(GC)電極，直徑3 mm)，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對電極為鉑片．采用循環(huán)伏安(CV)法在2 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-KCl(pH 7.0)溶液中對MWCNT-PAMAM/GC電極進(jìn)行電化學(xué)表征．移取5 μL 0.5 g·L-1MWCNT-PAMAM分散液涂覆至預(yù)處理過的GC電極表面，干燥后制得MWCNT-PAMAM/GC電極．

2 結(jié)果與討論

2.1 MWCNT-PAMAM復(fù)合物微觀形貌表征

圖2為MWCNT-COOH、MWCNT-NH2和不同反應(yīng)級數(shù)MWCNT-PAMAM復(fù)合物的TEM圖．由圖2 A可知，經(jīng)混酸處理后，MWCNTs被截短；MWCNT-COOH表面較平滑，碳納米管的中空結(jié)構(gòu)清晰可見．EDA修飾后制得的MWCNT-NH2表面變粗糙(圖2 B)．與MWCNT-COOH、MWCNT-NH2相比，PAMAM枝狀高分子修飾的MWCNTs(圖2 C～F)形貌有明顯不同．由圖2 C(MWCNT-G1.0)可知，PAMAM分子已連接至MWCNTs表面，其密度較高并分布相對均勻．但PAMAM分子在MWCNTs表面分布是不連續(xù)的，在MWCNTs的端口和彎曲處似乎連接有更多的PAMAM分子．這可能是由于在MWCNT-COOH端口和彎曲處具有更多的缺陷位點[11]，因而在混酸處理的過程中，這些位點生成了更多官能團(tuán)(羧基)的緣故．隨著反應(yīng)級數(shù)的增加，MWCNT-PAMAM復(fù)合物(MWCNT-G2.0，MWCNT-G3.0和MWCNT-G4.0，如圖2 D, E, F所示)直徑有所增大；其在MWCNTs表面形成相對均一的膜，這在圖2 F(MWCNT-G4.0)中可更清晰地觀察到：PAMAM分子幾乎覆蓋了整個單根碳納米管表面，其厚度在10 nm以內(nèi)．圖2說明PAMAM分子已成功修飾至MWCNTs表面．另外，可選擇在合適的步驟終止反應(yīng)，以控制MWCNTs上修飾的PAMAM分子的覆蓋度和尺寸；并可通過控制MWCNT-PAMAM復(fù)合物表面端基的種類和數(shù)量，以改變MWCNT-PAMAM復(fù)合物的表面性質(zhì)．

圖2 MWCNT-COOH (A), MWCNT-NH2 (B), MWCNT-G1.0 (C), MWCNT-G2.0 (D), MWCNT-G3.0 (E) 和MWCNT-G4.0 (F)的TEM圖．A, B, C, D, E, F中的插圖為其相對應(yīng)的放大TEM圖

2.2 MWCNT-PAMAM復(fù)合物FTIR、紫外-可見光譜、電化學(xué)表征

圖3 MWCNT-COOH (A, I線), MWCNT-NH2 (A, II線), MWCNT-G0.5 (B, I線) 和MWCNT-G1.0 (B, II線) 的FTIR圖

其他反應(yīng)級數(shù)的MWCNT-PAMAM復(fù)合物也采用紅外光譜進(jìn)行了表征．結(jié)果表明外表面端基為酯基的MWCNT-PAMAM復(fù)合物(MWCNT-G1.5、MWCNT-G2.5和MWCNT-G3.5)紅外光譜與MWCNT-G0.5相似；而端基為氨基的復(fù)合物(MWCNT-G2.0、MWCNT-G3.0和MWCNT-G4.0)紅外光譜與MWCNT-G1.0相似．另外，隨著反應(yīng)級數(shù)的增加，紅外光譜中酯基、氨基的特征峰增強(qiáng)，說明隨著反應(yīng)級數(shù)的增加，MWCNT-PAMAM復(fù)合物外表面端基數(shù)量增多．

圖4為MWCNT-NH2(曲線I)、MWCNT-G4.0(曲線II)的紫外-可見光譜圖．PAMAM分子最大特征吸收峰出現(xiàn)在270到300 nm的范圍內(nèi)[9]．對于MWCNT-NH2，在此范圍內(nèi)無明顯的吸收峰．MWCNT-G4.0復(fù)合物在λmax=280 nm處有一個尖的吸收峰．此結(jié)果進(jìn)一步說明在MWCNTs表面已成功修飾PAMAM分子．

以[Fe(CN)6]3-/4-為氧化還原探針[15]，采用CV法對端基為氨基的MWCNT-PAMAM修飾電極進(jìn)行了電化學(xué)表征．由圖5可知，所有的電極都顯示出好的氧化還原電流峰；峰電位差(ΔEp)約為80 mV；且隨著反應(yīng)級數(shù)的增加，ΔEp沒有明顯的變化，但氧化還原峰電流密度增加(MWCNT-G4.0/GC電極的氧化峰電流密度達(dá)到12.68 A/m2，約為MWCNT-NH2/GC電極3.36 A/m2的3.8倍)．這可能是由于MWCNT-PAMAM復(fù)合物表面帶正電端氨基的數(shù)量隨著反應(yīng)級數(shù)的增加而增加，從而增加了帶負(fù)電的[Fe(CN)6]3-/4-探針發(fā)生氧化還原反應(yīng)的活性位點所致．

2.3 MWCNT-PAMAM復(fù)合物固定BSA性能的TEM表征

MWCNT-PAMAM復(fù)合物外表面有很多官能團(tuán)(如端氨基)[16]，這對生物大分子的固定非常有利．因此，對MWCNT-PAMAM蛋白質(zhì)(在此選用BSA作為模型蛋白質(zhì))固定性能進(jìn)行了研究．如圖6所示，MWCNT-NH2(圖6 A)的BSA固定量相對較少，大多在MWCNTs的端口和彎曲處．隨著反應(yīng)級數(shù)的增加，BSA分子的覆蓋率增加(圖6 B-F所示)．由圖6 E可觀察到BSA分子幾乎覆蓋了MWCNT-G4.0整個外表面，但其分布不均勻；從放大的TEM圖(圖6 F)中可看出，有BSA包裹到單根MWCNT-G4.0表面形成了一層相對均一的膜．這說明MWCNT-PAMAM復(fù)合物非常適合于BSA的固定．與MWCNT-NH2相比，MWCNT-PAMAM(特別是MWCNT-G4.0)具有更優(yōu)的蛋白質(zhì)固定能力．

圖4 MWCNT-NH2 (I 線) 和 MWCNT-G4.0 (II 線) 圖5 MWCNT-NH2 (1線), MWCNT-G1.0 (2線), 的紫外-可見光譜．MWCNT-NH2 和 MWCNT-G2.0 (3線),MWCNT-G3.0 (4線) 和 MWCNT-G4.0 水溶液的濃度: 0.5 g·L-1 MWCNT-G4.0 (5線) 修飾電極在2 mmol·L-1 [Fe(CN)6]3-/4- KCl(pH 7.0)中的CV曲線．掃速: 50 mV s-1

圖6 MWCNT-NH2-BSA (A), MWCNT-G1.0-BSA (B), MWCNT-G2.0-BSA (C), MWCNT-G3.0-BSA (D) 和MWCNT-G4.0-BSA (E)的TEM圖．F為MWCNT-G4.0-BSA放大的TEM圖

3 結(jié)論

采用交替的Michael加成、酰胺化反應(yīng)可將PAMAM分子成功原位修飾至MWCNTs表面；可通過控制反應(yīng)的級數(shù)來控制MWCNT-PAMAM復(fù)合物尺寸大?。S著反應(yīng)級數(shù)的增加，PAMAM分子尺寸增大，經(jīng)4個反應(yīng)循環(huán)后能覆蓋單根MWCNT表面，形成一層相對均一的納米薄膜．與MWCNT-NH2相比，MWCNT-PAMAM復(fù)合物具有更好的BSA固定能力；此復(fù)合物也可用于其他生物大分子固定，在生物大分子細(xì)胞內(nèi)傳輸載體、生物傳感器等領(lǐng)域?qū)⒕哂休^好的應(yīng)用潛力．

參考文獻(xiàn)：

[1] CALABRETTA M K, KUMAR A, MCDERMOTT A,etal. Antibacterial activities of poly(amidoamine) dendrimers terminated with amino and poly(ethylene glycol) groups[J]. Biomacromolecules, 2007, 8(6):1 807-1 811.

[2] FISCHER M, VOGTLE F. Dendrimers:From design to application-a progress report[J]. Angew Chem Int Ed, 1999, 38:884-905.

[3] DUNCAN R, IZZO L. Dendrimer biocompatibility and toxicity[J]. Adv Drug Delivery Rev, 2005, 57:2 215-2 237.

[4] BOAS U, HEEGAARD P M H. Dendrimers in drug research[J]. Chem Soc Rev, 2004, 33:43-63.

[5] OOE M, MURATA M, MIZUGAKI T,etal. Dendritic nanoreactors encapsulating Pd particles for substrate-specific hydrogenation of olefins[J]. Nano Lett, 2002, 2(9):999-1 002.

[6] VOGTLE F, GESTERMANN S, HESSE R,etal. Functional dendrimers[J]. Prog Polym Sci, 2000, 25:987-1 041.

[7] JIA Z J, WANG Z Y, XU C,etal. Study on poly(methyl methacrylate)/carbon nano-tube composites[J]. Mater Sci Eng, 1999, A271:395-400.

[8] CAO L, YANG W L, YANG J W,etal. Hyperbranched poly(amidoamine)-modified multi-walled carbon nanotubes via grafting-from method[J]. Chem Lett, 2004, 33(5):490-491.

[9] PAN B F, CUI D X, CAO F,etal. Growth of multi-amine terminated poly(amidoamine) dendrimers on the surface of carbon nanotubes[J]. Nanotech, 2006, 17:2 483-2 489.

[10] TOMALIA D A, BAKER H, DEWALD J,etal. A new class of polymer:Starburst-dendritic macromolecules[J]. Polym J, 1985, 17(1):117-132.

[11] HUANG W, TAYLOR S, FU K,etal. Attaching proteins to carbon nanotubes via diimide-activated amidation[J]. Nano Lett, 2002, 2(4):311-314.

[12] XIA H, WANG Q, QIU G. Polymer-encapsulated carbon nanotubes prepared through ultrasonically initiated in situ emulsion polymerization[J]. Chem Mater, 2003, 15(20):3 879-3 886.

[13] CHAN J C Y, BURUGAPALLI K, NAIK H,etal. Amine functionalization of cholecyst-derived extracellular matrix with generation 1 PAMAM dendrimer[J]. Biomacromlecules, 2008, 9:528-536.

[14] POPESCU M C, FILIP D, VASILE C,etal. Characterization by fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and 2D IR correlation spectroscopy of PAMAM dendrimer[J]. J Phys Chem B, 2006, 110(29):14 198-14 211.

[15] RUAN C M, YANG L J, LI Y B. Immunobiosensor chips for detection of escherichia coli O157:H7 using electrochemical impedance spectroscopy[J]. Anal Chem, 2002, 74(18):4 814-4 820.

[16] GEBHART C L, KABANOV A V. Evaluation of polyplexes as gene transfer agents[J]. J Control Release, 2001, 73(2-3):410-416.