絞股藍(lán)有效成分殺滅釘螺效果和毒理研究

梁慧,耿鵬，倪紅，馬安寧，熊哲

(1. 武漢大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 湖北 武漢 430070;2.湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062;3.湖北大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430062)

目前，殺滅釘螺(Oncomelaniahupensis)仍是控制血吸蟲病流行的重要手段[1].化學(xué)藥物是國內(nèi)外使用較多的滅螺藥，如氯硝柳胺(Niclosamide)，五氯酚鈉(Na-pcp)等，但這些滅螺藥物對人畜、水生動植物有危害，其殘留物在環(huán)境中不易降解[2].從1933年至今已有1 000多種植物用于滅螺試驗(yàn)，其中發(fā)現(xiàn)有20多種具有強(qiáng)烈的滅螺作用.而我們通過研究獲得的階段性成果證實(shí)：絞股藍(lán)﹑夾竹桃﹑天南星、羊蹄、楓楊﹑天名精等十幾種植物對釘螺具有很強(qiáng)的毒殺作用[3].絞股藍(lán)是一種經(jīng)濟(jì)作物，在我國廣泛種植，本實(shí)驗(yàn)通過提取絞股藍(lán)有效成分總皂甙與總黃酮類物質(zhì)[4]，探討它們對釘螺的協(xié)同滅螺效果，并通過掃描電鏡和透射電鏡以及測定藥液對釘螺各部位膽堿酯酶(CHE)與乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響來探討其殺螺機(jī)理[5-7].為尋求到一種低毒、高效、價(jià)格低廉的滅螺藥物，提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料和方法

1.1材料絞股藍(lán) (Gynostemmapentaphyllum) 購于湖北神農(nóng)架；釘螺(Oncomelaniahupensis)采自荊州地區(qū).

1.2主要儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號: RE-52AA，上海亞榮)、傅立葉變換紅外光譜儀(規(guī)格型號：SPECTRUM ONE，技術(shù)指標(biāo): 檢測器 MIRTGS，掃描范圍:4 000～450 cm-1，分辨率:0.5～4.0 cm-1，紅外光源：MIR)；Hitachi H-600型掃描電鏡.

1.3 絞股藍(lán)有效成分的提取和初步鑒定

1.3.1 絞股藍(lán)有效成分Ⅰ和Ⅱ的提取 參見文獻(xiàn)[8-9]進(jìn)行，略有改動.

1.3.2 上述有效成分的鑒定 將上述2種有效成分分別用傅立葉變換紅外光譜儀和化學(xué)試劑進(jìn)行鑒定分析，再與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)圖譜對照，初步鑒定它們的結(jié)構(gòu).

1.4絞股藍(lán)水提物的制備將絞股藍(lán)全草洗凈風(fēng)干，粉碎，按干重和水體積1∶10的比例，加入去氯清水，在室溫(約25 ℃)浸泡3 d 后，紗布過濾，濾渣再按上述處理2次，合并濾液，在水浴鍋中蒸發(fā)水分，并將剩余物在65 ℃ 烘箱中烘至恒重，得絞股藍(lán)水提物，將其磨成粉并過80目篩，待用.

1.5絞股藍(lán)有效成分滅螺實(shí)驗(yàn)將絞股藍(lán)水提物粗粉、絞股藍(lán)有效成分Ⅰ和Ⅱ以及Ⅰ和Ⅱ等比例混合物分別用去氯清水配成濃度梯度為0.062 5、0.125、0.250、0.500、1.000 g/L 的溶液，采用WHO“殺螺劑實(shí)驗(yàn)室終篩方法”中的浸泡法，進(jìn)行浸殺釘螺實(shí)驗(yàn).同時(shí)以去氯清水飼養(yǎng)的釘螺作為對照.釘螺75只為1組(每一種處理為一組)，每15 只裝入一個(gè)尼龍網(wǎng)袋中，分別將各組(5袋/組)釘螺浸入盛有500 mL 的上述不同濃度溶液的玻璃缸中，每隔24 h 從各處理中隨機(jī)取出1袋釘螺，作存活檢查，統(tǒng)計(jì)死亡率.上述每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)在25 ℃下進(jìn)行.

1.6 殺螺毒理分析

1.6.1 電鏡樣品制備 分別取出在絞股藍(lán)混合液0.500 g/L 濃度下浸泡24 h 后的釘螺和去氯清水飼養(yǎng)的釘螺，分離取出其肝部、頭部、足部后放入2.5% 戊二醛溶液中固定，再分別用乙醇梯度脫水，乙腈置換，真空干燥，噴金，在Hitachi H-600 型掃描電鏡下觀察[10].

1.6.2 釘螺各部位膽堿酯酶(CHE)、乳酸脫氫酶(LDH)的酶活性測定 分別取出經(jīng)絞股藍(lán)混合液不同濃度浸泡48 h后的釘螺與去氯清水飼養(yǎng)的釘螺，分離出釘螺肝部、頭部、足部，分別加預(yù)冷的0.2 mol/L pH 7.1磷酸緩沖液(0.1 mL /只)制樣，每樣30只釘螺，冰浴勻漿，4 ℃條件離心(12 000 r/min，10 min)，取上清液待測[7].用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測試.

2 結(jié)果與分析

2.1絞股藍(lán)有效成分的紅外光譜鑒定絞股藍(lán)有效成分Ⅰ和Ⅱ的紅外光圖譜(infrared absorption spectroscopy，IR)見圖1、2.

圖1 絞股藍(lán)有效成分Ⅰ的紅外圖譜

圖2 絞股藍(lán)有效成分Ⅱ的紅外圖譜

2.2絞股藍(lán)有效成分的滅螺效果將絞股藍(lán)水提物和絞股藍(lán)單一有效成分以及它們等比例混合物配成5種不同濃度的水溶液，分別浸殺釘螺，毒殺效果結(jié)果見表1.實(shí)驗(yàn)表明：隨處理液濃度的增加和時(shí)間的延長，各種處理?xiàng)l件下的釘螺死亡率呈上升趨勢，殺螺效果依次為：絞股藍(lán)混合液>單一成分>水提物，有效成分Ⅰ和Ⅱ滅螺效果相當(dāng)，混合液濃度為0.250 g/L，72 h就能達(dá)到93.33%殺螺效果.

2.3 殺螺毒理分析

2.3.1 SEM電鏡分析 用0.500 g/L 絞股藍(lán)混合液處理釘螺24 h 后分別取出肝部、頭部和足部，做掃描電鏡觀察，結(jié)果見圖3～8.從圖中可見，對照組釘螺肝臟外被的內(nèi)臟囊表面呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，隨肝臟實(shí)質(zhì)組織一起形成溝回(圖3)，經(jīng)處理后的釘螺肝臟表面節(jié)后受到破壞，溝回部分消失，肝臟部分溶蝕，出現(xiàn)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)(圖4)；對照組釘螺頭部(圖5)表面有成行的迂曲皺褶，皺褶上有密集的顆粒，呈球狀或橢圓形，經(jīng)處理后的釘螺頭部皺褶被破壞，形成凹凸的嵴，呈索狀排列(圖6)；對照組足跖肌表面有清晰成行的褶皺，褶皺不迂回(圖7)，經(jīng)處理后的釘螺足部褶皺出現(xiàn)缺失，且顯得雜亂(圖8).

圖3、5、7 分別為對照釘螺肝部、頭部和足部；圖4、6、8 分別為0.500 g/L 混合液處理釘螺24 h后的釘螺肝部、頭部和足部

表1 絞股藍(lán)水提物及各有效成分滅螺效果比較

2.3.2 CHE與LDH酶活性變化分析 經(jīng)不同濃度絞股藍(lán)混合液浸泡釘螺48 h后，測得釘螺的肝部、全身和頭足部的CHE與LDH酶的活性變化，結(jié)果見圖9、圖10.

圖9 不同濃度混合液對釘螺各部位CHE酶活的影響

圖10 不同濃度混合液對釘螺各部位LDH酶活的影響

由圖9可知，隨著處理液濃度的升高，全身與肝部的CHE酶活性有一定升高，但隨著濃度的增加，酶活性逐步減弱.而頭足部則是在混合液濃度較大時(shí)，酶活力減弱較多，這表明，高濃度的絞股藍(lán)混合液對釘螺頭足部CHE影響較大，中毒相對于全身與肝部也較深.

由圖10可知，釘螺的頭足部、肝部和全身的LDH酶活力隨著混合液中濃度的增加變化不盡相同.在低濃度下，3 種酶活急劇下降后又迅速上升，隨后開始逐步下降，全身的LDH酶活隨著濃度的增加變化不大，而肝部的LDH酶活則隨著濃度的增加一直下降，而頭足部的LDH酶活則隨著濃度的增加而增加，這表明，高濃度的絞股藍(lán)混合液使釘螺肝部LDH酶活下降明顯.

3 討論

3.1絞股藍(lán)有效成分的滅螺效果據(jù)報(bào)道絞股藍(lán)整株水浸液[3]與絞股藍(lán)皂甙類物質(zhì)具有很好的殺螺效果[11].本實(shí)驗(yàn)以提取出的絞股藍(lán)總皂甙和總黃酮類物質(zhì)為毒殺釘螺成分，比較了絞股藍(lán)單一有效成分和它們的混合成分水溶液滅螺效果，實(shí)驗(yàn)表明，隨著藥液濃度的升高與時(shí)間的延長，其對釘螺的毒殺效果逐漸增強(qiáng)，在相同濃度條件下，絞股藍(lán)混合液滅螺效果優(yōu)于單一組分，不同絞股藍(lán)有效成分有協(xié)同滅螺作用.但兩種有效成分的最佳配比以及與其它植物源滅螺成分的協(xié)同滅螺作用還有待進(jìn)一步研究.

3.2 殺螺毒理分析

3.2.1 掃描電鏡表征 通過對釘螺的頭足部與肝臟的掃描電鏡觀察，絞股藍(lán)混合有效成分溶液對釘螺毒殺作用顯著，混合液浸殺后的釘螺頭部表面皺褶破壞，形成凹凸的嵴，褶皺消失，出現(xiàn)潰爛變形；釘螺足部的足跖肌及殼軸肌纖維被破壞，出現(xiàn)缺失，且顯得雜亂，可見有許多小孔洞，肝部部分溶蝕，迂回消失，看到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，說明絞股藍(lán)混合液對釘螺組織具有機(jī)械性破壞作用，且這種損傷作用隨浸泡時(shí)間的延長而逐漸加重，這與譚蘋報(bào)道的結(jié)果相一致[10，12].

3.2.2 CHE、LDH的測定酶活力 用酶促動力學(xué)法測定絞股藍(lán)混合液浸泡后的釘螺肝部、頭足部和整個(gè)軟體的膽堿酯酶(CHE)和乳酸脫氫酶(LDH)的酶活性發(fā)現(xiàn)，隨著藥液濃度的增加，釘螺頭足部CHE受抑制明顯，CHE是一類糖蛋白，存在于釘螺頭足部及神經(jīng)干，檢測其變化在臨床上就有應(yīng)用[13].CHE的降低標(biāo)志著釘螺運(yùn)動功能喪失，CHE是釘螺神經(jīng)性質(zhì)和功能的參考指標(biāo).LDH 是無氧呼吸過程中的重要酶[14]，實(shí)驗(yàn)表明，在肝部LDH的酶活性受明顯抑制，LDH酶活性的下降說明絞股藍(lán)混合液影響釘螺糖酵解代謝，當(dāng)混合藥液濃度比較低時(shí)，混合液刺激了釘螺頭部CHE和肝部LDH的合成，兩種酶活性均有升高，這表明釘螺表現(xiàn)出應(yīng)激反應(yīng)，用以增強(qiáng)釘螺的解毒能力；當(dāng)混合藥液濃度比較高時(shí)，由于混合藥液作用強(qiáng)度超過了釘螺生理閾限及解毒能力，抑制了酶的活性，釘螺物質(zhì)代謝和能量代謝出現(xiàn)紊亂，從而導(dǎo)致釘螺死亡，這與陳盛霞報(bào)道的相一致[15].

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