次甲基藍(lán)與DNA作用的共振光散射光譜研究及機(jī)理分析

盛立嬌，彭毛，周建剛，宋功武

(湖北大學(xué) 有機(jī)功能分子合成與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062)

脫氧核糖核酸(DNA)是重要的生物大分子,也是遺傳信息的載體和基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ). 核酸的定量測(cè)定可為生物體體液中其他組分的測(cè)定及遺傳疾病的診斷提供重要信息,因而成為人們關(guān)注和研究的重要課題.DNA內(nèi)源熒光很弱,因而直接利用其天然熒光進(jìn)行研究受到限制，共振光散射法逐漸成為研究熱點(diǎn)[1-5].

在早期的熒光分析中,散射光常作為一種干擾源而被消除.1993年,Pasternack等使用普通的熒光分光光度計(jì)建立了共振光散射(Resonance Light Scattering,RLS)技術(shù),研究卟啉分子在DNA分子表面的組裝和聚集[1].黃承志等人在此基礎(chǔ)上做了大量的研究工作并將其作為高靈敏方法應(yīng)用于核酸的測(cè)定[2-4].RLS法測(cè)定核酸主要利用具有大共軛體系的“生色團(tuán)”(染料或金屬螯合物)在核酸分子上的聚集作用或長(zhǎng)距組裝而產(chǎn)生強(qiáng)烈的共振散射,作為生色團(tuán)的主要是有機(jī)小分子堿性染料,卟啉類(lèi)試劑(如TAPP及其質(zhì)子化產(chǎn)物[2])及金屬螯合陽(yáng)離子(如CO(Ⅱ)-5-Cl-PADAB螯合物[3])等.目前，利用增強(qiáng)有機(jī)染料共振光散射測(cè)定核酸的報(bào)道有藏紅T[4],羅丹明B[5],耐爾藍(lán)硫酸鹽[6],亮綠[7]和中性紅[8]等.

圖1 次甲基藍(lán)的分子結(jié)構(gòu)

亞甲基藍(lán)(即次甲基藍(lán)，一種深藍(lán)色的水溶性染料，分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)已在近中性介質(zhì)中(pH 5.5～7.5)被作為共振光散射探針測(cè)定脫氧核糖核酸[9]，但在早期研究中只是作為一種新方法提出.筆者在文獻(xiàn)[9]的基礎(chǔ)上研究了次甲基藍(lán)(MB)在偏酸性介質(zhì)中(pH 3.51～4.49)與DNA作用的共振光散射光譜,對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了詳細(xì)優(yōu)化，并應(yīng)用紅外光譜、紫外-可見(jiàn)吸收光譜等初步探討了MB與DNA作用的機(jī)理.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑RF-540熒光分光光度計(jì)(日本島津); UV-2300紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)PE公司); 傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)PE公司);pHB-4 pH計(jì)(上海雷磁儀器廠); WH-2微型旋渦混流儀(上海滬西分析儀器廠).

Tris(三羥甲基氨基甲烷)- HCl 緩沖溶液,濃度為 0.1 mol·L-1; 脫氧核糖核酸溶液:將一定量的小牛胸腺DNA(ctDNA，華美生物工程公司)于0～4 ℃下緩慢溶于二次蒸餾水中,并于低溫保存，操作液濃度為90 mg·L-1.次甲基藍(lán)(MB)儲(chǔ)備液濃度為5.04×10-3mol ·L-1,操作液濃度為5.04×10-4mol·L-1.用1 mol·L-1的NaCl水溶液控制離子強(qiáng)度.所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.

1.2實(shí)驗(yàn)方法在25 mL 比色管中依次加入0.3 mL MB溶液,適量DNA溶液,1.0 mL Tris-HCl 緩沖溶液,用二次蒸餾水稀釋至10 mL,旋渦混合,放置5 min.將溶液置于λem=λex處進(jìn)行同步掃描,可得共振光散射光譜.于最大共振光散射峰368 nm處測(cè)量核酸加入前后溶液的共振光散射強(qiáng)度差ΔIRLS.

2 結(jié)果與討論

2.1 MB-DNA體系的共振光散射(RLS)光譜圖2為MB-DNA體系的共振光散射光譜(RLS光譜).結(jié)果表明,堿性染料次甲基藍(lán)本身的RLS信號(hào)較微弱,在加入DNA后,其RLS信號(hào)大大增強(qiáng),在368、470、550 nm左右出現(xiàn)了增強(qiáng)的共振光散射峰,但368 nm處的增強(qiáng)信號(hào)較明顯且峰形較好,本實(shí)驗(yàn)選擇368 nm為測(cè)量波長(zhǎng).

2.2條件優(yōu)化

2.2.1 介質(zhì)酸度的選擇 向海艷等[9]研究了亞甲基藍(lán)與脫氧核糖核酸在近中性范圍內(nèi)(pH=5.5～7.5)的共振光散射光譜.而本文以Tris-HCl 緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值,旨在研究偏酸性范圍內(nèi)，次甲基藍(lán)共振光散射法測(cè)定DNA含量的各種條件及有機(jī)染料與生物大分子的作用機(jī)理.Tris-HCl 緩沖溶液的用量在1.0～1.8 mL時(shí)RLS強(qiáng)度較大.因此，實(shí)驗(yàn)選擇用1.0 mL pH=4.49的Tris-HCl 緩沖溶液控制介質(zhì)的酸度.

2.2.2 離子強(qiáng)度的影響 用1 mol·L-1的NaCl 水溶液控制離子強(qiáng)度,測(cè)定MB-DNA體系的共振光散射強(qiáng)度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.由圖可知,當(dāng)NaCl溶液的濃度小于0.01 mol·L-1時(shí),溶液的離子強(qiáng)度對(duì)體系幾乎無(wú)影響；繼續(xù)增大離子強(qiáng)度則會(huì)導(dǎo)致體系RLS強(qiáng)度逐漸減小.因此,在體系中應(yīng)避免有高濃度的電解質(zhì)存在,在配置緩沖溶液時(shí),應(yīng)盡量避免以電解質(zhì)作為緩沖介質(zhì).離子強(qiáng)度的影響從一定程度上說(shuō)明了MB與DNA之間存在靜電相互作用[3].

2.2.3 試劑加入順序的影響及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)中試劑的加入順序?qū)LS影響不大，但當(dāng)按照染料MB-DNA-緩沖溶液時(shí),體系的共振光散射強(qiáng)度最大.按順序加入試劑,放置4～5 min后,反應(yīng)基本完成,體系在至少35 min內(nèi)測(cè)定,結(jié)果穩(wěn)定.

2.2.4 DNA熱變性的影響 實(shí)驗(yàn)研究了熱變性DNA(將DNA 在沸水浴中加熱30 min后迅速放入冰水浴中冷卻15 min以防止其復(fù)性)和天然DNA 對(duì)體系RLS 強(qiáng)度的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4.由圖可知,熱變性DNA的共振光散射強(qiáng)度增大,這是由于高溫和迅速冷卻使得雙螺旋的DNA 解鏈為單鏈,有利于MB分子在DNA表面的堆積.

圖 2 MB-DNA 體系共振光散射光譜CMB:1.512×10-5 mol·L-1; pH=4.49;CDNA(mg·L-1)(1→4): 0.0,0.9,1.8,2.7.

圖3 離子強(qiáng)度對(duì)MB-DNA體系RLS的影響CMB:1.512×10-5 mol·L-1;pH=4.49;CDNA: 1.8 mg·L-1.

圖 4 天然DNA(1)和變性DNA(2)對(duì)體系RLS強(qiáng)度的影響CMB: 1.512×10-5 mol·L-1;pH=4.49.

2.2.5 共存物質(zhì)的干擾 在0.9 mg·L-1DNA 存在下,考慮了多種共存物質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響,結(jié)果見(jiàn)表1.從表1 可以看出,大多數(shù)生物體內(nèi)存在的金屬離子(如Ca2+和Ba2+)和氨基酸以及糖類(lèi)不干擾測(cè)定,說(shuō)明該方法具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.由于Fe3+會(huì)與DNA發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),干擾此實(shí)驗(yàn),故在實(shí)驗(yàn)前,應(yīng)將其除去.BSA對(duì)體系干擾很大,這是由于BSA與MB產(chǎn)生相似反應(yīng)之故.

表1 共存物質(zhì)對(duì)測(cè)定DNA的影響

2.2.6 工作曲線 在上述確定的最佳反應(yīng)條件下,繪制了測(cè)定DNA 的工作曲線.當(dāng)DNA 的質(zhì)量濃度為0～1 440 ng·mL-1時(shí),體系的共振光強(qiáng)度與DNA 的質(zhì)量濃度呈較好的線性關(guān)系.其工作曲線的線性擬合方程為ΔIRLS=-2.442 + 49.765C(C: mg/L)(pH=4.49),相關(guān)系數(shù)為r=0.995 3.該方法檢測(cè)限(3σ)為14.1 ng·mL-1.

2.2.7 合成樣品的測(cè)定 根據(jù)表1 中共存離子組分干擾允許量配置了3個(gè)合成樣品.表2列出了合成樣品的測(cè)定結(jié)果,證明此法重復(fù)性好,結(jié)果令人滿意.

表2 合成樣品中DNA的測(cè)定

3 機(jī)理探討

有機(jī)分子與生物大分子相互作用的機(jī)理是研究的熱點(diǎn)，已有人使用分子吸收和發(fā)射光譜及圓二色譜等方法進(jìn)行研究[10-11]，本文中是在應(yīng)用RLS法測(cè)定DNA含量的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，綜合應(yīng)用紅外光譜、紫外-可見(jiàn)吸收光譜、RLS光譜等光譜技術(shù)，并結(jié)合離子強(qiáng)度對(duì)體系RLS信號(hào)的影響來(lái)初步探討MB與DNA作用的機(jī)理.

圖 5 MB-DNA 體系的紅外光譜(1)DNA,(2)MB-DNA.

3.2 RLS光譜除了可以應(yīng)用RLS法靈敏測(cè)定生物大分子的含量外，還能根據(jù)共振光散射光譜研究有機(jī)分子在核酸分子表面的長(zhǎng)距組裝.根據(jù)文獻(xiàn)[6,10-11]解釋,帶正電荷的有機(jī)分子對(duì)核酸具有凝聚作用(condensing effect),當(dāng)有機(jī)分子與核酸的摩爾比較高且介質(zhì)的離子強(qiáng)度很低時(shí),有機(jī)分子在核酸分子表面進(jìn)行長(zhǎng)距組裝(long range assembly),形成遠(yuǎn)程堆積結(jié)構(gòu)并將誘導(dǎo)核酸超螺旋結(jié)構(gòu)的形成,當(dāng)光與核酸的超螺旋結(jié)構(gòu)作用時(shí)便產(chǎn)生了光共振現(xiàn)象，導(dǎo)致共振光散射增強(qiáng).因而，如果有機(jī)分子與核酸作用時(shí)導(dǎo)致強(qiáng)烈的RLS信號(hào)增強(qiáng)，則意味著該有機(jī)分子在核酸表面進(jìn)行堆積，形成了一種核酸超螺旋結(jié)構(gòu).本實(shí)驗(yàn)中，MB與DNA的結(jié)合，從圖1看出,隨著DNA的加入,體系的共振光散射增強(qiáng),可初步說(shuō)明MB分子在DNA分子表面長(zhǎng)距組裝,形成大的聚集體.

圖 6 MB-DNA體系吸收光譜CMB: 1.512×10-5 mol·L-1; pH=4.49;CDNA(mg·L-1)(1-8):0.0,2.7,4.5,13.5,22.5,45.0,63.0,88.2.

3.3紫外-可見(jiàn)吸收光譜次甲基藍(lán)(MB)，吖啶橙(AO)，耐爾藍(lán)A(NB)，中性紅(NR)，羅丹明6G(R6G)等離子型染料在水溶液中都存在單體(M)-二聚體(D)平衡(the monomer-dimer equilibrium,M+M=D)[12].次甲基藍(lán)，別名品藍(lán)，屬于醌亞胺類(lèi)染料，可用作染料，生物染色劑，氧化還原指示劑等，水溶液中其單體的吸收峰位于668 nm處，而二聚體的吸收帶位于612 nm處[13].圖6為體系的紫外-可見(jiàn)吸收光譜.圖6曲線1中612 nm即MB二聚體的吸收峰，而664 nm處即單體吸收.由圖可知,當(dāng)DNA加入已發(fā)生聚集的MB溶液中,體系在664 nm處的吸收下降(曲線1～4),發(fā)生減色效應(yīng)并伴隨著波長(zhǎng)紫移.根據(jù)共振光散射理論，增強(qiáng)的RLS信號(hào)與紫外光譜的減色效應(yīng)，可進(jìn)一步確定MB在DNA分子表面的堆積和長(zhǎng)距組裝[4].當(dāng)DNA的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大,吸收峰又開(kāi)始增大,波長(zhǎng)紅移.其原因有二，可能是隨著MB單體與DNA反應(yīng),單體-二聚體平衡朝單體方向移動(dòng),使二聚體(D)濃度降低[9].此外，當(dāng)DNA濃度增加到一定值后，MB與DNA的作用可能經(jīng)歷了從表面聚集(H-aggregation)到解聚(dissociation mechanism)的轉(zhuǎn)變[4],不利于MB與DNA的反應(yīng).

3.4從離子強(qiáng)度的影響角度探討作用機(jī)理從微觀上分析，有機(jī)小分子與核酸結(jié)合的部位是堿基,磷酸骨架和戊糖環(huán),作用的方式主要分為3種:不可逆的共價(jià)結(jié)合,剪切結(jié)合和可逆的非共價(jià)結(jié)合[14].其中非共價(jià)作用是研究的熱點(diǎn),其基本方式有:靜電作用、溝槽作用、嵌插作用和遠(yuǎn)程組裝與外圍結(jié)合(亦稱(chēng)長(zhǎng)距組裝)幾種方式[14].靜電作用主要是陽(yáng)離子小分子沿著核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)的雙壁與負(fù)電荷的磷酸根發(fā)生反應(yīng),小分子與核酸的這種相互作用可根據(jù)離子強(qiáng)度對(duì)測(cè)定體系的影響進(jìn)行判斷[15].

由圖3看出，當(dāng)NaCl溶液的濃度大于0.01 mol·L-1后，繼續(xù)增大離子強(qiáng)度則會(huì)導(dǎo)致體系RLS強(qiáng)度逐漸減小，這是因?yàn)镸B的分子結(jié)構(gòu)中環(huán)外N原子帶正電荷，可與DNA骨架上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)作用，而Na+也能以靜電引力的方式與磷酸基相互作用，從而離子強(qiáng)度的增大削弱了陽(yáng)離子染料MB與DNA之間的靜電引力，不利于次甲基藍(lán)與DNA的結(jié)合.據(jù)此分析，MB與DNA的結(jié)合有一定的靜電作用.

綜合上述分析可知,MB可能通過(guò)靜電作用等以DNA分子為模板在其表面形成了聚集和長(zhǎng)距組裝,這種聚集增強(qiáng)了體系的RLS響應(yīng)[3],并成為定量測(cè)定核酸的基礎(chǔ).

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