浙江省蝴蝶蘭細(xì)菌性軟腐病病原鑒定

吳志毅，方 媛，陳 曦，張慧麗，張明哲，李 斌

(1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州310012；2.浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部作物病蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310029；3.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 寧波315012)

蝴蝶蘭Phalaenopsis細(xì)菌性軟腐病是國內(nèi)外蝴蝶蘭生產(chǎn)上的一大障礙，病原學(xué)研究進(jìn)一步顯示假單胞細(xì)菌 Pseudomonas sp.[1]，菊歐文氏菌 Erwinia chrysanthemi[2]和 大白菜 軟腐病 菌 Erwinia carotovora subsp.carotovora[3]都能引起該病害的發(fā)生。2007年上半年，在浙江省杭州市浙江大學(xué)華家池校區(qū)花卉苗圃栽培的蝴蝶蘭上出現(xiàn)的細(xì)菌病害，初期主要危害葉片，不論新葉或老葉都會(huì)發(fā)生，葉片感染后出現(xiàn)水浸狀斑點(diǎn)，隨即迅速擴(kuò)大，感病部位內(nèi)部組織被細(xì)菌分解成液體狀態(tài)，葉片失去支撐力而下垂。水浸狀病斑處顏色較深，與淺綠色健康組織有明顯區(qū)別。腐爛處發(fā)出臭氣，然后病部組織崩潰，內(nèi)溶物流出，病葉呈紙狀干枯。高溫、高濕、不通風(fēng)的環(huán)境容易誘發(fā)該病的發(fā)生。病部切片在低倍顯微鏡下均能觀察到噴菌現(xiàn)象。為明確浙江省蝴蝶蘭細(xì)菌性軟腐病到底是由哪一種病菌引起，為蝴蝶蘭病害的有效治理提供切實(shí)可行的依據(jù)，筆者對(duì)該病開展了病原鑒定研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株與病原細(xì)菌分離

菊歐文氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，Erwinia chrysanthemi ATCC11662和SCH-1分別由上海市出入境檢驗(yàn)檢疫局和浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所提供。其他參考標(biāo)準(zhǔn)菌株Xanthomonas axonopodis pv.poinsettiicola LMG 849和LMG5401以及Pseudomonas syringae pv.syringae LMG5570和LMG2231均由比利時(shí)根特大學(xué)國家菌種保藏中心提供。首先，鏡檢樣本上是否有其他可見病原物，然后取無真菌菌絲或孢子的典型病株樣本3份。病部葉表經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇消毒后，在肉汁胨培養(yǎng)基(NA)上劃線分離，平板在28℃下培養(yǎng)3 d后于挑取代表菌落進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。

1.2 病原的常規(guī)細(xì)菌學(xué)及Koch假說測(cè)定

菌落形態(tài)、培養(yǎng)性狀、煙草過敏性反應(yīng)及Koch假說測(cè)定按Klement等[4]方法；生理生化測(cè)定按Schaad等[5]方法。離體致病性測(cè)定參照Yessad等[6]的方法進(jìn)行。Koch氏病原假說測(cè)定的蝴蝶蘭品種為 “火鳥”，將所測(cè)菌株濃度調(diào)節(jié)到1011個(gè)°L－1，采用針刺法在蝴蝶蘭的葉片上接種，5 d后開始記錄發(fā)病情況。接種后放置28℃的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 病原的Biolog鑒定

選取3株有代表性的菌株，分別命名為H-1，H-2和H-3，用Biolog進(jìn)行證實(shí)，在含95個(gè)碳源的Biolog陰性(GN)微孔板中，加入150 mL°孔-1所測(cè)細(xì)菌懸浮液(吸光度值0.3)。在30℃下培養(yǎng)24 h后由Biolog讀數(shù)機(jī)測(cè)得反應(yīng)結(jié)果，并直接進(jìn)入Biolog專用細(xì)菌鑒定程序(4.1版本)。具體操作參照文獻(xiàn)[7－8]的方法。

1.4 病原的脂肪酸甲基酯(FAME)鑒定

FAME鑒定采用Agilent 6890型氣相色譜系統(tǒng)。參照MIDI公司說明書及文獻(xiàn)[7－8]的方法進(jìn)行。所有純化的參試菌株先在NA培養(yǎng)基上于30℃生長24 h后，轉(zhuǎn)入TSBA固體培養(yǎng)基上再培養(yǎng)24 h。然后用無菌塑料接種環(huán)挑取1環(huán)培養(yǎng)菌放入有螺帽的試管中，提取脂肪酸。鑒定結(jié)果通過微生物鑒定系統(tǒng)軟件——MIDI公司開發(fā)的基于細(xì)菌細(xì)胞脂肪酸成分鑒定細(xì)菌的MIS 4.5(microbial identification system)和LGS 4.5(library generation software)獲得。把結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌種的脂肪酸信息進(jìn)行比對(duì)。

1.5 16S基因序列分析

根據(jù)已發(fā)表[9]的植物病原細(xì)菌16S的通用引物對(duì)分離的致病細(xì)菌進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，正反向引物分別為: P1 (5’-GTTACCGACAGAATAAGCACCC-3’ )和 P2(5’-CCTACGGCTACCTTGT TACGAC-3’ )。擴(kuò)增反應(yīng)體積 20.0 μL: DNA 模板 1.0 μL； P1(10.0 μmol°L－1)0.5 μL； P2(10.0 μmol°L－1)0.5 μL； 2 × Taq PCR StarMix 10.0 μL，雙蒸水補(bǔ)足至 20.0 μL。反應(yīng)條件為 94 ℃預(yù)變性 5 min；94℃變性25 s，65℃退火25 s，72℃延伸l min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；最后4℃保存。PCR反應(yīng)在PTC-200型熱循環(huán)儀上進(jìn)行，取5.0 μL反應(yīng)液在10.0 g°kg－1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，得到1.5 kb左右大小的條帶。將PCR產(chǎn)物送華大生物技術(shù)責(zé)任公司克隆并測(cè)序。將得到的測(cè)序結(jié)果在 GenBank(登錄 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行 blast比對(duì)。

1.6 16S基因聚類分析

以測(cè)序得到的3條16S序列為材料，利用ClustalX軟件將測(cè)得的16S序列與已報(bào)道的菊歐文氏菌和相近屬種的18條16 S序列進(jìn)行序列對(duì)齊和同源性序列的多重排定，MEGA 3.1構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)誤差用Bootstrap方法(replications=1 000)，NJ，MP，ME和UPGMA系統(tǒng)樹通過MEGA 3.1軟件得出，系統(tǒng)樹中節(jié)點(diǎn)的自舉置信水平(bootstrap confidence level，BCL)應(yīng)用自引導(dǎo)(bootstrap)估計(jì)，共1 000次循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原的細(xì)菌學(xué)特征

來自不同樣品的3株蝴蝶蘭分離菌株的革蘭氏染色反應(yīng)均為陰性，菌體桿狀，具周生鞭毛3～8根，能游動(dòng)，兼性厭氧，不產(chǎn)生芽孢。在NA培養(yǎng)基上于28℃生長3 d，菌落乳白色，扁平，褶皺有光澤，大小0.5～1.0 μm ×1.0～3.0 μm。在 KMB(Kings Medium B Agar)培養(yǎng)基上不產(chǎn)生熒光色素。它們與菊歐文氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Erwinia chrysanthemi ATCC11662和SCH-1的反應(yīng)基本一致。

2.2 致病性測(cè)定

將3株蝴蝶蘭軟腐病分離細(xì)菌與2株菊歐文氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株E.chrysanthemi ATCC11662和SCH-1的菌液濃度調(diào)至1 011個(gè)°L－1的菌懸液接種煙草Nicotiana tabacum，觀察其過敏性反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有菌株在接種后24 h后均產(chǎn)生明顯的過敏性反應(yīng)，呈灰色暈圈，而無菌水對(duì)照無過敏性反應(yīng)。Koch氏測(cè)定表明，在接種后的第3～4天，蝴蝶蘭葉片發(fā)病，病狀為水漬狀病斑，呈半透明狀，組織軟腐，有惡臭味。從接種發(fā)病的病葉上分離獲得同樣病原。

2.3 Biolog鑒定

2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菊歐文氏菌菌株的Biolog鑒定結(jié)果與原鑒定完全一致，其相似性分別為0.85和0.76。3株蝴蝶蘭分離菌代表菌株的Biolog測(cè)定結(jié)果顯示，它們均被鑒定為Erwinia chrysanthemi，Biolog相似性在0.77～0.82，接近或超過標(biāo)準(zhǔn)菌株，具有很高的可信度(表1)。

表1 3株蝴蝶蘭軟腐病細(xì)菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的Biolog鑒定結(jié)果Table 1 Biolog identity of 3 soft rot bacteria of moth orchid and standard reference strains

2.4 病原菌的脂肪酸甲基酯(FAME)鑒定結(jié)果

FAME鑒定結(jié)果匹配程度遵循Buyer等的原則:相似性系數(shù)＜0.2，結(jié)果不可用；相似性系數(shù)≥0.5，鑒定到種。6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株和3株蝴蝶蘭軟腐病細(xì)菌的FAME鑒定結(jié)果與Biolog鑒定完全一致(表2)，其中2株Erwinia chrysanthemi標(biāo)準(zhǔn)菌株的FAME相似度在0.84和0.79，3株蝴蝶蘭軟腐病細(xì)菌的FAME相似度在0.67～0.75，均接近或超過標(biāo)準(zhǔn)菌，表明本次FAME鑒定結(jié)果真實(shí)可靠。

2.5 病原菌的16S序列分析

登錄GenBank進(jìn)行序列比較，結(jié)果表明，3株檢測(cè)菌株與E.chrysanthemi，Dickeya dadantii的同源性均高達(dá)99%。但根據(jù)上述的細(xì)菌學(xué)特征、Biolog和FAME分析鑒定及其在蝴蝶蘭上的致病性測(cè)定(后一種病原在蝴蝶蘭上不致病)，可以排除后一種病原細(xì)菌的可能性。

表2 3株蝴蝶蘭軟腐病細(xì)菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的脂肪酸鑒定結(jié)果Table 2 FAME identity of 3 soft rot bacteria of moth orchid and standard reference strains

圖1 蝴蝶蘭細(xì)菌性軟腐病菌與相近種的16S基因分子系統(tǒng)樹Figure 1 Phylogenetic tree derived from the 16S rDNA gene sequences analysis between soft rot bac teria of moth orchid and related species

2.6 16S基因的聚類分析

根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型，用NJ法構(gòu)建的的16S rDNA基因的分子系統(tǒng)樹(圖1)。圖1表明，3株檢測(cè)菌株的16S序列與Erwinia chrysanthemi標(biāo)準(zhǔn)菌株以較高的自舉置信值聚在一起，而與其他屬種分離開來。充分說明本研究中引起蝴蝶蘭軟腐的病原菌是E.chrysanthemi，并證實(shí)了前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 討論

經(jīng)過對(duì)來自不同蝴蝶蘭植物樣品的3個(gè)分離菌株的主要細(xì)菌學(xué)特性、菌落形態(tài)、致病性、Biolog、FAME鑒定，16S序列分析及與2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的比較，證實(shí)了在杭州市出現(xiàn)的蝴蝶蘭軟腐是由E.chrysanthemi引起的。本研究未發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭植物樣品中有其他病原細(xì)菌的存在。

由于Pseudomonas sp.，Erwinia carotovora sp.carotovora和E.chrysanthemi都已經(jīng)被報(bào)道能引起蝴蝶蘭軟腐病的發(fā)生，在植物上表現(xiàn)的癥狀也比較相似。此時(shí)，全面了解這3種病菌特別是后2種病菌在菌落形態(tài)上的區(qū)別，對(duì)于及時(shí)準(zhǔn)確地識(shí)別到底是哪一種病菌引起的蝴蝶蘭軟腐病非常必要。E.carotovora sp.carotovora病菌在大多數(shù)培養(yǎng)基上的菌落是淡灰白色至乳酪色，光滑、圓形，有光澤，輕微隆起，在24 h后出現(xiàn)肉眼可見菌落。E.chrysanthemi病菌雖然在大多數(shù)培養(yǎng)基上的菌落也呈淡灰白色至乳酪色，光滑、圓形，但邊緣漸變成波狀至羽毛狀，較扁平或輕微隆起，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)上3～6 d后，菌落似 “煎雞蛋”狀，中央突起并有波狀邊緣；另外在葡萄糖碳酸鈣(YDC)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～10 d后很多菌株產(chǎn)生深藍(lán)色非水溶性色素。

3株蝴蝶蘭分離菌株和2個(gè)對(duì)照菌株的Biolog圖譜和FAME脂肪酸圖譜都和數(shù)據(jù)庫中的Erwinia chrysanthemi病菌顯示了非常高的相似性，顯示了這2種技術(shù)都可以應(yīng)用于浙江蝴蝶蘭細(xì)菌性軟腐病菌的鑒定研究。同時(shí)，浙江蝴蝶蘭細(xì)菌性軟腐病菌與相近種的分子系統(tǒng)發(fā)育樹顯示E.chrysanthemi與E.carotovora sp.carotovora病菌在16S序列上差異明顯，這為分別設(shè)計(jì)特異性引物檢測(cè)這2種病原細(xì)菌提供了可能。此外，Li等[10]報(bào)道了Erwinia chrysanthemi病菌引起杭州地區(qū)石斛蘭Dendrobium的莖腐病，然而筆者的研究則是第1次發(fā)現(xiàn)該病菌引起浙江地區(qū)蝴蝶蘭的軟腐病，究竟從不同寄主如石斛蘭和蝴蝶蘭上分離的病菌間是否存在遺傳多樣性，仍有待進(jìn)一步研究。

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