PPARγ激動劑對急性胰腺炎小鼠肝損傷的影響

孫俊濤 許剛 田克立

·短篇論著·

PPARγ激動劑對急性胰腺炎小鼠肝損傷的影響

孫俊濤 許剛 田克立

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是一類依賴配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，許多研究表明PPARγ通過抑制NF- κB的活化來發(fā)揮抗炎作用[1-3]。本實驗應(yīng)用PPARγ激動劑干預(yù)急性胰腺炎(AP)小鼠，觀察其肝臟NF-κB和PPARγ的表達，探討AP肝功能損傷機制及探索新的治療途徑。

一、材料和方法

1．實驗動物及分組：健康雄性昆明小鼠72只，體重(30±2)g，購自山東大學(xué)實驗動物中心。按數(shù)字表法將小鼠隨機分為對照組、AP組和羅格列酮干預(yù)組(干預(yù)組)，每組24只。采用腹腔注射雨蛙肽(50 μg/kg體重，Sigma公司)建模，每小時注射一次，共7次。干預(yù)組在建模前30 min腹腔內(nèi)注射羅格列酮(CAYMAN CHEMICAL 公司)10 mg/kg體重，AP組注射等容積的生理鹽水，對照組僅腹腔注射等量生理鹽水。制模后6、12、24 h摘眼球取血，分離血清。引頸脫臼處死小鼠，收集肝臟標本，液氮凍存。

2．血清淀粉酶、ALT和AST含量檢測：采用TOSHIBA-40FR全自動生化分析儀測定。

3．肝臟組織NF-κB和PPARγ mRNA測定：采用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取肝組織總RNA。采用RT-PCR法檢測NF-κB和PPARγ mRNA。PPARγ 上游引物 5′-CGTGATGGAAGACCACTCGC-3′，下游引物5′-AACCTGATGGCATTGTGAGA-3′，產(chǎn)物477 bp; NF-κB上游引物5′-GTGACAAGCCTGTAGCC-3′，下游引物 3′-CCAGATGAAACCCTAGTAA-5′ ,產(chǎn)物867 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-TGGTGGGAATGGGTCAGA-3′，下游引物 5′-ACGGTTGGCCTTAGGGTT-3′,產(chǎn)物218 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis試劑盒(Invitrogen公司)說明書進行。PPARγ PCR反應(yīng)條件：94℃ 1 min，60℃ 50 s，72℃ 1 min，32個循環(huán)。β-actin反應(yīng)條件：94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min， 28個循環(huán)。NF-κB反應(yīng)條件：94℃ 1 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min， 35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離,圖像分析儀掃描，利用AlphaImager2200軟件進行灰度測定，以目的條帶與內(nèi)參β-actin的灰度值比作為mRNA的相對表達量。

4．肝組織PPARγ和NF-κB蛋白表達檢測：采用Western blotting方法。組織蛋白按PIPA裂解液(蓋寧生物科技有限公司 )說明書提取。抗NF-κB p65、PPARγ、β-actin抗體均購自Santa Cruz公司。結(jié)果用圖像掃描分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比表示蛋白相對表達量。

二、結(jié)果

1．血清淀粉酶、ALT和AST的變化：AP組和干預(yù)組血清淀粉酶、ALT和AST水平均較對照組顯著升高(P值均lt;0.01)；干預(yù)組血清淀粉酶、ALT和AST水平又均顯著低于同時間點的AP組(P值lt;0.01或lt;0.05，表1)。

2．肝臟組織PPARγ和NF-κB mRNA表達的變化：AP組PPARγ mRNA表達較對照組下降，6 h和12 h點具有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.01和Plt;0.05)；干預(yù)組PPARγ mRNA表達水平明顯高于同時點的AP組和對照組(P值均lt;0.01，表1，圖1)。AP組NF-κB mRNA表達水平較同時點對照組均顯著升高(P值均lt;0.01)，其中以12 h時升高最顯著；干預(yù)組NF-κB mRNA表達明顯高于對照組但又均顯著低于同時點AP組(P值均lt;0.01，表1，圖2)。

3．肝臟組織PPARγ和NF-κB 蛋白表達的變化：AP組PPARγ蛋白表達均低于同時點的對照組(P值均lt;0.05)；干預(yù)組PPARγ蛋白表達均顯著高于同時點AP組和對照組(P值均lt;0.01，表1，圖3)。肝臟組織NF-κB p65蛋白各時點的表達結(jié)果均為AP組gt;干預(yù)組gt;對照組，各時點各組間均有顯著性差異(P值均lt;0.01)，其中AP組在制模后12 h升高最顯著(表1，圖4)。

1、3、5分別為24、12、6 h干預(yù)組；2、4、6分別為24、12、6 h AP組；7為6 h對照組

圖1小鼠肝臟組織PPARγ mRNA 的表達

1、3、5分別為24、12、6 h干預(yù)組；2、4、6分別為24、12、6 h AP組；7為6 h對照組

圖2 小鼠肝臟組織NF-κB mRNA 的表達

注：與對照組比較，aPlt;0.05，bPlt;0.01；與AP組比較，cPlt;0.05，dPlt;0.01

1、3、5分別為24、12、6 h AP組；2、4、6分別為24、12、6 h干預(yù)組；7為6 h對照組

圖3小鼠肝臟組織PPARγ蛋白表達

1、3、5分別為24、12、6 h AP組；2、4、6分別為24、12、6 h干預(yù)組；7為6 h對照組

圖4小鼠肝臟組織NF-κBp65蛋白表達

討論AP常伴有全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)發(fā)生,若得不到有效控制，可并發(fā)多器官功能衰竭綜合征(MODS),最終危及生命。肝臟具有物質(zhì)代謝、分泌、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能。因其血供豐富，在AP時非常容易合并損傷，80%的AP患者有肝功能損害[4]。肝臟損害程度與AP嚴重程度密切相關(guān)，且影響病程和預(yù)后。本實驗結(jié)果顯示，AP組和干預(yù)組小鼠血清淀粉酶、ALT和AST水平較對照組均明顯升高；干預(yù)組又明顯低于AP組，說明AP組存在肝損傷，而羅格列酮能減輕肝損傷的程度。

Dunn等[5]在AP早期的胰腺提取物中發(fā)現(xiàn)NF-κB DNA結(jié)合活動明顯增強，而抑制NF-κB活性可阻止淀粉酶水平升高，促進炎癥恢復(fù)。Satoh等[6]報道，NF-κB在AP造模后6 h就出現(xiàn)活化。本實驗用雨蛙肽復(fù)制AP模型，結(jié)果顯示對照組肝臟NF-κB微弱表達；AP組肝臟NF-κB活性明顯升高，說明AP時肝臟組織中NF-κB被活化；干擾組小鼠肝臟NF-κB的表達則明顯低于AP組，表明羅格列酮對AP小鼠肝臟NF-κB表達有抑制作用。實驗證實，NF-κB的活化能增加炎癥介質(zhì)(如IL-6、IL-8、TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1等)的表達[7-8]。因此，羅格列酮通過抑制NF-κB活化而減輕組織的損害。

近年研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ除在糖和脂肪代謝、免疫調(diào)節(jié)、細胞生長和分化中起作用外，還在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。Rollins等[9]應(yīng)用PPARγ激動劑能呈劑量依賴性減輕AP的嚴重程度，認為PPARγ在AP早期階段的炎癥級聯(lián)中起著直接作用。Ivashchenko等[10]報道，雨蛙肽能加重胰腺上皮PPARγ敲除小鼠所致的炎癥反應(yīng)，且羅格列酮在水腫、巨噬細胞浸潤和促炎細胞因子表達方面的抗炎效應(yīng)與對照組相比顯著減弱，提示胰腺上皮PPARγ在抑制炎癥過程中發(fā)揮重要作用。本實驗結(jié)果顯示，PPARγ在AP組肝臟中表達明顯降低，羅格列酮干預(yù)后，PPARγ表達量顯著升高，與國外研究結(jié)果一致。

總之，肝臟NF-κB參與并能加重AP時肝損傷過程，羅格列酮有可能通過激活PPARγ的活性、抑制NF-κB的活化起到減輕肝臟損傷程度的作用，為AP治療提供新的思路。

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[10] Ivashchenko CY,Duan SZ,Usher MG,et al. PPAR-gamma knockout in pancreatic epithelial cells abolishes the inhibitory effect of rosiglitazone on caerulein-induced acute pancreatitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,293:G319-G326.

2009-05-20)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.023

257034 山東東營，山東省東營市勝利油田中心醫(yī)院消化內(nèi)科(孫俊濤)；中國人民解放軍濟南軍區(qū)第四五六醫(yī)院消化內(nèi)科(許剛)；山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所(田克立)

田克立，Email:tiankeli@sdu.edu.cn