• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷中的作用

    2010-11-24 01:24:15趙小勇程雪燕田新邵磊石書偉莫小華
    中華胰腺病雜志 2010年2期
    關(guān)鍵詞:光鏡胰腺炎胰腺

    趙小勇 程雪燕 田新 邵磊 石書偉 莫小華

    ·論著·

    巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷中的作用

    趙小勇 程雪燕 田新 邵磊 石書偉 莫小華

    目的檢測急性壞死性胰腺炎(severe acute pancreatitis, ANP)大鼠肺組織巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)mRAN表達(dá)及TNF-α含量,探討它們在ANP肺損傷中的作用機(jī)制。方法40只SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組及ANP 3、6、12 h組。采用5%牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g體重)膽胰管逆行注射方法制備ANP模型。取血檢測血清淀粉酶。取胰腺組織和肺組織行病理學(xué)檢查,并稱重計(jì)算其濕/干重比。采用RT-PCR法檢測肺組織MIF mRNA表達(dá),放免法測定肺組織TNF-α含量。結(jié)果ANP 組血淀粉酶、胰腺和肺組織濕/干重比顯著升高,病理損傷隨時(shí)間延長逐漸加重。ANP 3、6、12 h組肺組織TNF-α含量分別為(0.69±0.07)ng/ml、(1.64±0.10)ng/ml和(0.92±0.11)ng/ml;MIF mRNA表達(dá)量分別為1.97±0.09、2.55±0.23、3.29±0.26,均顯著高于對(duì)照組的(0.19±0.06)ng/ml和1.21±0.34(P值均lt;0.01)。肺組織MIFmRNA表達(dá)與肺組織病理損傷、肺濕/干重比、TNF-α含量均呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.637、r=0.684、r=0.858,P值均lt;0.01。肺組織TNF-α含量與肺損傷、肺濕/干重比均呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.540和r=0.421,P值均lt;0.01。結(jié)論ANP大鼠肺組織MIFmRNA過表達(dá),TNF-α含量顯著增加,它們共同參與肺損傷的發(fā)生。

    胰腺炎,急性壞死性; 肺損傷; 巨噬細(xì)胞游走抑制因子; 腫瘤壞死因子α

    約1/3的重癥急性胰腺炎(SAP)患者會(huì)發(fā)展到急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory dysfunction syndrome,ARDS),約60%的患者在SAP發(fā)病的第一周因ALI/ARDS病死[1]。因此,探討SAP并發(fā)ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制對(duì)于降低SAP患者病死率有重要意義。

    巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子( macrophage migration inhibitory factor,MIF)廣泛分布于腦垂體、肺臟、肝臟、腎上腺、子宮等部位,其主要功能是抑制巨噬細(xì)胞游走,促進(jìn)其在炎癥局部浸潤,并分泌多種細(xì)胞因子。它也是糖皮質(zhì)激素抗炎作用的內(nèi)源性拮抗物[2],在ALI/ARDS的發(fā)病過程中起重要作用[3]。因此,本實(shí)驗(yàn)檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺組織MIF基因表達(dá),探討其在ANP并發(fā)ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制中的作用。

    材料與方法

    一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

    成年SD大鼠40只,體重250~300 g,清潔級(jí),雌雄不限,購自昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照(3 h)組,ANP 3、6、12 h組,每組10只。采用膽胰管逆行注射5%?;悄懰徕c(Sigma公司)0.1 ml/100 g體重方法制備ANP模型。對(duì)照組僅翻動(dòng)胰腺后關(guān)腹。按各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,取血,并取胰腺和肺組織。

    二、觀察指標(biāo)及方法

    1.血清淀粉酶:采用全自動(dòng)生化分析儀。

    2.胰腺和肺組織濕/干重比:取胰腺體部和右肺下葉組織用電子稱稱其濕重,置于80℃烘箱烘烤24 h后稱其干重,計(jì)算胰腺、肺組織的濕/干重比。

    3.胰腺和肺臟組織病理學(xué)檢查:取胰尾、右肺中葉組織,常規(guī)切片、HE染色。由病理科醫(yī)師閱片,并參考Schimidt等[4]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胰腺進(jìn)行評(píng)分,參考 Osman等[5]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肺組織評(píng)分。

    4.肺組織TNF-α測定:取左肺新鮮組織,吸去血跡,稱重約400 mg,放入生理鹽水研磨制成勻漿,離心,取上清液于-20℃保存。采用TNF-α放射免疫試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)檢測。

    5.肺組織MIF mRNA檢測:取新鮮肺組織,在液氮中研磨成粉末,應(yīng)用RNA抽提試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)抽取總RNA。應(yīng)用RT-PCR方法檢測MIF mRNA表達(dá)。MIF上游引物 5′-ATG-CCTATGTTCATCGTGAAC-3′,下游引物5′-GGC-TCAAGCGAAGGTGGAAC-3′,擴(kuò)增片斷341 bp;內(nèi)參β-actin上游引物5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATG-3′,下游引物5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAG-3′,擴(kuò)增片斷349 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。先采用Revert AidTM First Strand CDNA Systhesis Kit(Fermentas公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng): 95℃ 3 min,94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s,33個(gè)循環(huán),最后72℃ 7 min。產(chǎn)物經(jīng)電泳分離,圖像自動(dòng)捕獲系統(tǒng)掃描,以MIF與β-actin電泳帶灰度值之比作為mRNA表達(dá)的相對(duì)值。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    結(jié) 果

    一、血清淀粉酶活性變化

    對(duì)照組血淀粉酶活性為(524.10±122.92)U/L,ANP 3、6、12 h組分別為(4365.20±884.37)U/L、(9019.70±7383.15)U/L和(11534.90±7165.35)U/L,較正常對(duì)照組顯著升高(Plt;0.01)。

    二、腹水量、胰腺濕/干重比及病理組織學(xué)改變

    ANP 3、6、12 h組大鼠腹水量為(6.44±2.35)ml、(8.96±3.63)ml和(13.19±9.21)ml,均顯著多于對(duì)照組的(0.51±1.10)ml(P值均lt;0.01);胰腺濕/干重比為6.53±0.73、8.25±0.83、10.44±0.96,均顯著高于對(duì)照組的4.36±0.36(P值均lt;0.01)。

    對(duì)照組胰腺肉眼無明顯變化,光鏡見胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞形態(tài)正常(圖1a)。ANP 3 h組胰腺腫脹明顯,出現(xiàn)點(diǎn)片狀紫褐色壞死區(qū);光鏡見腺泡間質(zhì)水腫,小葉間隙增大,有點(diǎn)灶狀壞死區(qū),有少量炎細(xì)胞浸潤(圖1b)。6 h組胰腺質(zhì)地變硬,可見散在分布的皂化斑;光鏡見腺泡破壞,壞死區(qū)擴(kuò)大,有凝固性、脂肪性壞死(圖1c)。12 h胰腺有大片壞死灶,大網(wǎng)膜、腸系膜、腹后壁、腸壁可見大量黃色皂化斑;光鏡見腺泡小葉結(jié)構(gòu)破壞,血管破裂出血,壞死區(qū)有大量中性單核巨噬細(xì)胞浸潤(圖1d)。對(duì)照組和ANP 3、6、12 h組的胰腺病理評(píng)分分別為0.15±0.34、2.75±1.27、6.35±1.23、8.95±2.24,ANP各時(shí)間點(diǎn)組均較對(duì)照組顯著增加(Plt;0.01)。

    三、肺組織濕/干重比及病理改變

    對(duì)照組和ANP 3、6、12 h組的肺組織濕/干重比分別為4.24±0.25、5.61±9.62、6.90±0.53、8.45±0.80,ANP各組均較對(duì)照組顯著增加(Plt;0.01)。對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁完整 ,肺間質(zhì)無滲出(圖2a)。ANP 3 h組肺臟體積稍增大;鏡下見肺間質(zhì)增寬,充血水腫,有少量炎性細(xì)胞浸潤(圖2b)。6 h后肺體積增大更為顯著;光鏡下間質(zhì)明顯增寬,炎性細(xì)胞浸潤明顯增多,肺泡腔出血(圖2c)。12 h后肺間隔增寬,大量炎癥細(xì)胞浸潤,肺泡腔內(nèi)大量滲出物,肺泡腔塌陷,局灶性實(shí)變等(圖2d)。對(duì)照組和ANP 3、6、12 h組的肺病理評(píng)分分別為0.25±0.35、3.65±0.47、3.80±1.01、4.60±1.84,ANP各組均較對(duì)照組顯著增加(Plt;0.01)。

    四、肺組織MIF mRNA表達(dá)

    對(duì)照組肺MIF mRNA低水平表達(dá),表達(dá)量為1.21±0.34。ANP 3、6、12 h的MIF mRNA,表達(dá)量分別為1.97±0.09、2.55±0.23、3.29±0.26,均較對(duì)照組顯著增加(P值均lt;0.01,圖3)。

    五、肺組織TNF-α含量

    對(duì)照組和ANP 3、6、12 h組肺組織TNF-α含量分別為(0.19±0.06)ng/ml、(0.69±0.07)ng/ml、(1.64±0.10) ng/ml和(0.92±0.11 )ng/ml,ANP各組較對(duì)照組顯著增加(P值均lt;0.01)。

    六、相關(guān)性分析

    肺組織MIF mRNA表達(dá)與肺組織病理損傷、肺濕/干重比、TNF-α含量均呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.637、r=0.684、r=0.858,P值均lt;0.01。肺組織TNF-α含量與肺損傷,肺濕/干重比均呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.540和r=0.421,P值均lt;0.01。

    討 論

    大量研究顯示,在急性胰腺炎發(fā)病早期即存在炎性細(xì)胞因子過度釋放和失控的全身炎癥反應(yīng)。TNF-α是ANP發(fā)病后較早產(chǎn)生的細(xì)胞因子,其升高的程度與胰腺損傷程度直接相關(guān)聯(lián)[6]。它也是引起ALI的啟動(dòng)因子[7]。徐軍等[8]和Norman等[9]報(bào)道ANP大鼠肺TNF-α含量隨制模時(shí)間延長不斷升高。Winder等[10]用TNF-α拮抗劑治療可明顯減輕肺水腫。本實(shí)驗(yàn)提示,ANP組肺組織TNF-α水平明顯高于對(duì)照組,于6 h達(dá)到高峰,后略有下降,且肺組織TNF-α水平與肺的損傷程度呈正相關(guān),提示肺組織TNF-α參與肺損傷的發(fā)生。

    圖1 對(duì)照組(a)和ANP 3(b)、6(c)、12 h(d)組胰腺組織病理改變(HE ×100)

    圖2 對(duì)照組(a)和ANP 3(b)、6(c)、12 h(d)組肺組織病理改變(HE ×100)

    圖3 對(duì)照組(1,2)及ANP 3 h(3,4)、6 h(5,6)、12 h(7.8)組肺組織β-actin mRNA和MIF mRNA的表達(dá)

    巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)作為一種炎性細(xì)胞因子,一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素和一種催化酶,在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。MIF能抑制巨噬細(xì)胞游走,促進(jìn)巨噬細(xì)胞在炎癥局部浸潤、增生、激活及分泌一些細(xì)胞因子。ANP時(shí),炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子刺激肺臟巨噬細(xì)胞活化,釋放MIF,MIF可刺激單核巨噬細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),導(dǎo)致ALI/ARDS。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著胰腺病變的加重,肺組織出現(xiàn)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞浸潤,MIF mRNA表達(dá)增加,并與肺損傷程度呈正相關(guān),提示MIF介導(dǎo)了巨噬細(xì)胞在肺組織的浸潤,同時(shí)巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生MIF,形成正反饋,加重肺的損傷,與Donnelly等[11]的結(jié)果一致。Bernhagen等[12]用TNF-α誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放MIF,觀察到MIF反過來刺激巨噬細(xì)胞釋放TNF-α,使用抗MIF抗體則可降低腹膜炎鼠血漿TNF-α水平,提示TNF-α和MIF協(xié)同作用于前炎癥反應(yīng)環(huán)路,致病情加重,預(yù)后不良。本組肺組織MIFmRNA表達(dá)與TNF-α水平同步升高,呈顯著正相關(guān),也表明它們共同促進(jìn)ALI發(fā)生。

    [1] Shield CJ,Winter DC, Redmond HP.Lung injury injury in acute pancreatitis:mechanisms,prevention and therapy.Curr Opin Crit Care,2002,8:158-163.

    [2] Maxime V,Fitting C,Annane D,et al.Corticoids normalize leukocyte production of macrophage migration inhibitory factor in septic shock.J Infect Dis,2005,191:138-144.

    [3] Bacher M,Metz CN,Calandra T,et al.An essential regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in T-cell activation.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:7849-7854.

    [4] Schmidt J,Lewandrowsi K,Warshaw AL,et al.Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. Int J Pancreatol,1992,12:41-51.

    [5] Osman MO,Kristense JU,Jacoben NO,et al.A monoclonal anti-interleukin 8 anti-body(WS-4) inhibits cytokine response and acute lung injury in experimental acute necrotising pancreatitis in rabbits.Gut,1998,43:232-239.

    [6] Bhatia M,Brady M,Shokuhi S,et al.Inflammatory mediators in acute pancreatitis.J Pathol,2000,190:117-125.

    [7] Tsukahara Y,Morisaki T,Horita Y,et al.Phospholipase A2 mediates nitric oxide production by alveolar macrophages and acute lung injury in pancreatitis.Ann Surg,1999,229:385-392.

    [8] 徐軍,張梅,劉學(xué)民,等.TNF-α基因表達(dá)在大鼠急性重癥胰腺炎肺損傷中的作用.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2004,25:388-390.

    [9] Norman JG,Fink GW,Denham W.Tissne-specific cytokine production during experimental acute pancreatitis.A probale mechanism for distant organ disfunction.Dig Dis Sci,1997,42:1783-1788.

    [10] Winder AC,Mullen PG,Walsh CJ,et al.Delayed tumor necrosis factor a blockade attenuates pulmonary dysfunction and metabolic acidosis associated with experimental gram-negative sepsis.Arch Surg,1994,129:80-89.

    [11] Donnelly SC,Haslett C,Reid RT,et al.Regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in acute respiratory diseases syndrome.Nat Med,1997,3:320-323.

    [12] Bernhagen J,Mitchell RA,Calandra T,et al.Purification,bioactivity,and secondary structure analysis of mouse and human macrophage migration inhibitory factor(MIF).Biochemistry,1994,33:14144-14155.

    2009-03-06)

    (本文編輯:呂芳萍)

    RoleofintrapulmonaryexpressionofMIFmRNAinacutelunginjuryofratswithacutenecrotizingpancreatitis

    ZHAOXiao-yong,CHENGXue-yan,TIANXin,SHAOLei,SHIShu-wei,MOXiao-hua.

    DepartmentofPancreaticSurgery,PeoplesHospitalofJiaozuo,Jiaozuo454002,China

    MOXiao-hua,Email:mxh580@yahoo.com.cn

    ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of MIF mRNA and TNF-α in the lung tissue of rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP) and explore their mechanism of action in acute lung injury during the course of ANP.MethodsA total of 40 Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (n=10 in each group): the sham operation (SO) group, ANP 3h group, 6h group, 12h group. The model of ANP was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate (0.1 ml/100 g) into the biliary and pancreatic duct. The level of serum amylase was determined; pancreatic and lung tissues were harvested for pathological examination, and wet/dry weight ratios were estimated. Intrapulmonary expression of MIF mRNA was assayed by semi-quantitative RT-PCR. TNF-α in pulmonary homogenate was measured by immunoradiometric assay.ResultsSerum amylase, wet/dry weight ratios of pancreatic and lung tissues all significantly increased, and pathological injuries aggravated with time in ANP groups. Levels of TNF-α in ANP 3h, 6h, 12h group were (0.69±0.107) ng/ml, (1.64±0.10) ng/ml and (0.92±0.11)ng/ml, and expression of MIF mRNA were 1.97±0.09, 2.55±0.23, 3.29±0.26, which were significantly higher than those in control group [(0.19±0.06)ng/ml, 1.21±0.34,Plt;0.01]. Intrapulmonary expression of MIF mRNA was positively associated with lung pathological injuries, wet/dry weight ratio, and TNF-α(r=0.637,r=0.684,r=0.858,Plt;0.01). Intrapulmonary levels of TNF-α was positively associated with lung pathological injuries, wet/dry weight ratio (r=0.540,r=0.421,Plt;0.01).ConclusionsMIF mRNA was over-expressed and level of TNF-α was significantly increased in pulmonary tissue in rats with ANP, and this may be one of the mechanisms in the pathogenesis of lung injury in ANP.

    Pancreatitis,acute necrotizing; Lung injury; Macrophage migration-inhibitory factors; Tumor necrosis factor-alpha

    10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.012

    云南省教育廳科研基金資助項(xiàng)目(5Z0314C)

    454002 焦作,河南省焦作市人民醫(yī)院胰腺外科(趙小勇、程雪燕、田新、邵磊、石書偉);云南省昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腹部微創(chuàng)外科(莫小華)

    莫小華,Email:mxh580@yahoo.com

    猜你喜歡
    光鏡胰腺炎胰腺
    同時(shí)多層擴(kuò)散成像對(duì)胰腺病變的診斷效能
    漢皎光鏡銘文釋考
    東方考古(2021年0期)2021-07-22 06:26:16
    2 使用減光鏡進(jìn)行慢速快門拍攝
    孕期大補(bǔ)當(dāng)心胰腺炎
    流動(dòng)的城市
    慢性鼻竇炎鼻息肉內(nèi)鏡鼻竇術(shù)后上頜竇口黏膜恢復(fù)過程分析
    哪些胰腺“病變”不需要外科治療
    18例異位胰腺的診斷與治療分析
    急性胰腺炎致精神失常1例
    中西醫(yī)結(jié)合治療急性胰腺炎55例
    九九在线视频观看精品| 99久久综合免费| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产精品成人在线| 最近中文字幕2019免费版| 人妻一区二区av| 伊人久久精品亚洲午夜| 伦精品一区二区三区| 麻豆成人av视频| 五月开心婷婷网| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久久久伊人网av| 综合色丁香网| 国产日韩欧美视频二区| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 成年人免费黄色播放视频| 久久热精品热| 亚洲精品乱久久久久久| 人妻人人澡人人爽人人| 十八禁高潮呻吟视频| 免费看光身美女| 亚洲精品自拍成人| 男女高潮啪啪啪动态图| 日韩 亚洲 欧美在线| 一个人免费看片子| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 69精品国产乱码久久久| 五月玫瑰六月丁香| 丁香六月天网| 丰满饥渴人妻一区二区三| 99热这里只有精品一区| 在线观看人妻少妇| 午夜福利视频在线观看免费| 免费人成在线观看视频色| 亚洲国产精品999| 免费看不卡的av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 午夜影院在线不卡| 少妇的逼水好多| 久久久国产精品麻豆| 久久久午夜欧美精品| 十分钟在线观看高清视频www| 日日撸夜夜添| 亚洲av男天堂| 国产男女内射视频| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| av黄色大香蕉| 99热这里只有精品一区| 男女无遮挡免费网站观看| 久热这里只有精品99| a级片在线免费高清观看视频| 午夜福利,免费看| 全区人妻精品视频| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品99久久久久久久久| www.av在线官网国产| 高清av免费在线| 有码 亚洲区| 大片免费播放器 马上看| 久久午夜福利片| 大片免费播放器 马上看| 国产精品熟女久久久久浪| 国产黄色免费在线视频| 新久久久久国产一级毛片| 日日啪夜夜爽| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜免费观看性视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久久久久久久久久免费av| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产永久视频网站| 69精品国产乱码久久久| 久久久久久伊人网av| 高清av免费在线| 国产综合精华液| 成人无遮挡网站| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲成色77777| 99热国产这里只有精品6| xxxhd国产人妻xxx| 999精品在线视频| 亚洲国产精品999| 免费高清在线观看视频在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 久久久久精品久久久久真实原创| 一级毛片我不卡| 久久精品国产亚洲av天美| 看十八女毛片水多多多| 亚洲美女视频黄频| av不卡在线播放| 国产在线一区二区三区精| 精品酒店卫生间| 一区在线观看完整版| 国产精品女同一区二区软件| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 少妇高潮的动态图| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 国产精品久久久久久久电影| 久久人人爽人人爽人人片va| 丰满饥渴人妻一区二区三| 色5月婷婷丁香| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产av国产精品国产| 丝袜在线中文字幕| 大香蕉久久网| 成人国产av品久久久| 亚洲丝袜综合中文字幕| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日韩av免费高清视频| 在线 av 中文字幕| 久久婷婷青草| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 在线观看国产h片| 国产 精品1| 国产日韩欧美在线精品| 不卡视频在线观看欧美| 人人妻人人澡人人看| 亚洲av福利一区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲不卡免费看| 大陆偷拍与自拍| 国产成人免费观看mmmm| 简卡轻食公司| 热99久久久久精品小说推荐| av播播在线观看一区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久久久国产网址| 国产一区二区在线观看av| 久久午夜福利片| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日本黄大片高清| 最近最新中文字幕免费大全7| 我要看黄色一级片免费的| 在线观看免费视频网站a站| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 超碰97精品在线观看| av有码第一页| 午夜久久久在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久鲁丝午夜福利片| 精品久久久久久电影网| 在线免费观看不下载黄p国产| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲国产精品专区欧美| 韩国av在线不卡| www.av在线官网国产| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| .国产精品久久| 国产成人精品婷婷| 飞空精品影院首页| 欧美xxⅹ黑人| 啦啦啦视频在线资源免费观看| av在线老鸭窝| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本欧美视频一区| 最新中文字幕久久久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 成人亚洲欧美一区二区av| 精品午夜福利在线看| 国产乱来视频区| 少妇高潮的动态图| 国产亚洲最大av| 久久久久久人妻| 国产成人精品无人区| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲综合精品二区| 成年av动漫网址| 成年女人在线观看亚洲视频| 看十八女毛片水多多多| av视频免费观看在线观看| 看十八女毛片水多多多| 久久久久久久久久久久大奶| 黄片无遮挡物在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 伦精品一区二区三区| 满18在线观看网站| 三级国产精品欧美在线观看| freevideosex欧美| 亚洲性久久影院| 久久av网站| freevideosex欧美| 国产精品欧美亚洲77777| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产不卡av网站在线观看| 国产精品 国内视频| 一级毛片电影观看| videos熟女内射| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产精品久久久久成人av| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美另类一区| 天堂俺去俺来也www色官网| 伦精品一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 大香蕉97超碰在线| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产一区二区三区av在线| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美精品高潮呻吟av久久| 免费观看在线日韩| 一级片'在线观看视频| 老司机影院成人| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲精品亚洲一区二区| 午夜老司机福利剧场| 老女人水多毛片| 国产成人精品久久久久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 婷婷色av中文字幕| 久久国产精品大桥未久av| 色吧在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 国产免费现黄频在线看| 一级二级三级毛片免费看| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 人妻系列 视频| 黄色配什么色好看| 日韩一本色道免费dvd| 十八禁网站网址无遮挡| 久久久久国产精品人妻一区二区| a级毛色黄片| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 久久精品久久精品一区二区三区| 日韩一区二区三区影片| 日本91视频免费播放| av黄色大香蕉| 大陆偷拍与自拍| av播播在线观看一区| 激情五月婷婷亚洲| 丰满少妇做爰视频| 日本欧美视频一区| 满18在线观看网站| 日日撸夜夜添| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| www.av在线官网国产| 久久99蜜桃精品久久| 人人澡人人妻人| 97精品久久久久久久久久精品| 热re99久久精品国产66热6| 久久精品久久久久久久性| 中文字幕久久专区| 欧美激情国产日韩精品一区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 日韩伦理黄色片| 777米奇影视久久| 亚洲国产色片| 丝袜在线中文字幕| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 中国美白少妇内射xxxbb| 日本-黄色视频高清免费观看| 最新中文字幕久久久久| 国产精品免费大片| 亚洲成人手机| av不卡在线播放| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久久精品免费免费高清| 黄色一级大片看看| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜老司机福利剧场| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美日韩成人在线一区二区| 美女cb高潮喷水在线观看| av有码第一页| 免费av中文字幕在线| av在线app专区| 亚洲av日韩在线播放| 毛片一级片免费看久久久久| 精品人妻在线不人妻| 亚洲av.av天堂| 亚洲精品成人av观看孕妇| av有码第一页| 免费大片18禁| 久久久a久久爽久久v久久| 老司机影院毛片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 乱码一卡2卡4卡精品| 一区在线观看完整版| 免费观看的影片在线观看| 亚洲精品一二三| 国产成人精品婷婷| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 激情五月婷婷亚洲| videos熟女内射| 视频区图区小说| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 99热6这里只有精品| 亚洲av成人精品一二三区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 一边摸一边做爽爽视频免费| 老熟女久久久| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品aⅴ在线观看| 多毛熟女@视频| 午夜福利影视在线免费观看| 内地一区二区视频在线| 麻豆成人av视频| 26uuu在线亚洲综合色| 久久综合国产亚洲精品| 秋霞在线观看毛片| 日韩成人伦理影院| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲内射少妇av| 国产精品蜜桃在线观看| av有码第一页| 亚洲,一卡二卡三卡| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 色婷婷av一区二区三区视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 少妇被粗大的猛进出69影院 | videosex国产| av天堂久久9| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 成人无遮挡网站| 免费大片黄手机在线观看| 日本色播在线视频| 免费观看性生交大片5| 国产男人的电影天堂91| 亚洲精品日韩av片在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久午夜福利片| 秋霞伦理黄片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产精品一二三区在线看| 人妻 亚洲 视频| 人人妻人人澡人人看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日本wwww免费看| 在现免费观看毛片| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品国产露脸久久av麻豆| 精品一区二区免费观看| 久久久久久久精品精品| 亚洲少妇的诱惑av| 熟女电影av网| 国产成人精品婷婷| 黄色毛片三级朝国网站| 国产色婷婷99| 天天操日日干夜夜撸| xxxhd国产人妻xxx| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产黄色免费在线视频| 国产在视频线精品| www.av在线官网国产| 久久久久人妻精品一区果冻| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲图色成人| www.色视频.com| 高清在线视频一区二区三区| 一本色道久久久久久精品综合| 91成人精品电影| 桃花免费在线播放| 午夜影院在线不卡| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 老女人水多毛片| 一本色道久久久久久精品综合| 久久久国产欧美日韩av| 久久午夜综合久久蜜桃| 大陆偷拍与自拍| 大片电影免费在线观看免费| 51国产日韩欧美| 久久精品人人爽人人爽视色| 一级毛片 在线播放| a级毛色黄片| 亚洲国产日韩一区二区| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲精品国产av成人精品| 伦精品一区二区三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 高清视频免费观看一区二区| 一级片'在线观看视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产乱来视频区| 国产在线视频一区二区| 高清av免费在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 一级毛片 在线播放| 蜜桃国产av成人99| 免费高清在线观看日韩| 日韩制服骚丝袜av| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲精品自拍成人| 国产免费视频播放在线视频| 久久精品夜色国产| 天天操日日干夜夜撸| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| 99久国产av精品国产电影| 国产日韩欧美亚洲二区| 中文欧美无线码| 亚洲欧美清纯卡通| videosex国产| 国产成人精品婷婷| av线在线观看网站| 22中文网久久字幕| 精品少妇内射三级| av在线老鸭窝| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲精品国产av成人精品| 久久韩国三级中文字幕| 最近手机中文字幕大全| 美女中出高潮动态图| 涩涩av久久男人的天堂| 男人操女人黄网站| 丰满少妇做爰视频| 在线观看人妻少妇| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 热99久久久久精品小说推荐| 日本色播在线视频| videossex国产| 一级毛片aaaaaa免费看小| 女人精品久久久久毛片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产成人精品福利久久| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧美人与善性xxx| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲少妇的诱惑av| av免费在线看不卡| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 日韩大片免费观看网站| 一个人免费看片子| 国产亚洲最大av| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产伦理片在线播放av一区| 中文字幕最新亚洲高清| 久久久久久久久久久免费av| 高清不卡的av网站| 欧美三级亚洲精品| 婷婷色综合www| 久久热精品热| 久久久精品区二区三区| 欧美日韩在线观看h| 亚洲av在线观看美女高潮| 黑人高潮一二区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产亚洲欧美精品永久| 香蕉精品网在线| 精品久久久久久久久亚洲| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲精品亚洲一区二区| 三上悠亚av全集在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产乱人偷精品视频| 午夜激情久久久久久久| 在线精品无人区一区二区三| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 五月天丁香电影| 午夜福利网站1000一区二区三区| 成人二区视频| 亚州av有码| 伊人久久国产一区二区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | av播播在线观看一区| 国产精品久久久久久精品古装| 99热网站在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 夫妻午夜视频| 免费看光身美女| 久久97久久精品| 制服丝袜香蕉在线| 韩国av在线不卡| 制服诱惑二区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 又大又黄又爽视频免费| 在线观看免费视频网站a站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 熟女av电影| 国产免费一区二区三区四区乱码| 我的老师免费观看完整版| 成年人午夜在线观看视频| 国产 一区精品| videos熟女内射| 亚州av有码| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲情色 制服丝袜| 波野结衣二区三区在线| 少妇人妻精品综合一区二区| 在线观看免费日韩欧美大片 | 中国三级夫妇交换| 久久久久久久亚洲中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 97超碰精品成人国产| 黄色毛片三级朝国网站| 成人毛片60女人毛片免费| 丝袜脚勾引网站| 一区在线观看完整版| 国产成人精品一,二区| 一级片'在线观看视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲人与动物交配视频| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 人妻系列 视频| 99热网站在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 免费观看性生交大片5| 免费观看av网站的网址| 韩国av在线不卡| 亚洲熟女精品中文字幕| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日本wwww免费看| 丁香六月天网| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久久精品性色| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 精品亚洲乱码少妇综合久久| av天堂久久9| 亚洲无线观看免费| 一本久久精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 午夜影院在线不卡| 国产男女内射视频| 在线精品无人区一区二区三| xxxhd国产人妻xxx| 天天操日日干夜夜撸| 成年av动漫网址| 国产成人91sexporn| 热99久久久久精品小说推荐| 插阴视频在线观看视频| 国产免费福利视频在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久精品国产亚洲网站| 一级毛片 在线播放| 亚洲,欧美,日韩| 精品少妇内射三级| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av在线老鸭窝| 久久久久久久精品精品| 欧美日韩综合久久久久久| 韩国高清视频一区二区三区| 在线观看三级黄色| 99re6热这里在线精品视频| 99久久综合免费| 美女大奶头黄色视频| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产探花极品一区二区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲av国产av综合av卡| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品久久久久久精品古装| 男人操女人黄网站| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 伊人久久精品亚洲午夜| 成人漫画全彩无遮挡| 久久av网站| xxxhd国产人妻xxx| 赤兔流量卡办理| 国产黄片视频在线免费观看| 国产精品.久久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 秋霞伦理黄片| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美激情 高清一区二区三区| 午夜免费鲁丝| 久久女婷五月综合色啪小说| av不卡在线播放| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 中文字幕亚洲精品专区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久久精品免费免费高清| 天美传媒精品一区二区| 久久国产精品大桥未久av| 人妻少妇偷人精品九色| 精品熟女少妇av免费看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 成人免费观看视频高清| 国产男人的电影天堂91| 美女视频免费永久观看网站| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产成人免费无遮挡视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久免费观看电影|