趨化因子CCL20及其受體CCR6在急性壞死性胰腺炎中的表達(dá)及意義

周國雄 周德霞 丁曉凌 張海峰 張弘 成建萍 強(qiáng)暉 魏群 華國平

·論著·

趨化因子CCL20及其受體CCR6在急性壞死性胰腺炎中的表達(dá)及意義

周國雄 周德霞 丁曉凌 張海峰 張弘 成建萍 強(qiáng)暉 魏群 華國平

目的探討CC趨化因子配體20(CCL20)和CC趨化因子受體6(CCR6)在實(shí)驗(yàn)性急性壞死性胰腺炎(ANP)發(fā)病機(jī)制中的作用。方法48只SD大鼠按完全隨機(jī)法分為ANP組和對照組。采用膽胰管逆行注射4%牛磺膽酸鈉建立大鼠ANP模型,以注射等容積生理鹽水作為對照組。術(shù)后1 、3、6、12 h分批處死大鼠，取血檢測血清淀粉酶，胰腺組織常規(guī)病理檢查并評分，免疫組化和RT-PCR檢測胰腺組織中CCL20、CCR6 mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果ANP大鼠血清淀粉酶和胰腺組織病理評分明顯高于對照組。ANP組術(shù)后胰腺組織CCL20 mRNA及蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)(P<0.05)；術(shù)后6 h胰腺組織中CCR6 mRNA明顯高于對照組(0.88±0.05對0.23±0.09，P<0.01)，術(shù)后12 h CCR6 mRNA表達(dá)較6 h時(shí)降低，但仍高于對照組(0.37±0.10對0.15±0.07，P<0.05)，CCR6蛋白變化與其mRNA變化一致。結(jié)論CCL20和CCR6參與ANP的發(fā)生和發(fā)展。

胰腺炎，急性壞死性； 趨化因子，CC; 趨化因子受體

細(xì)胞因子，尤其是趨化因子在急性壞死性胰腺炎(ANP)發(fā)病過程中所起的作用越來越受到人們的重視。CC趨化因子配體20(CC chemokine ligand 20, CCL20)是近來發(fā)現(xiàn)的 CC 趨化因子家族的新成員，主要表達(dá)于肝臟、肺、淋巴結(jié)、胰腺及外周血細(xì)胞[1]。CC趨化因子受體6(CC chemokine receptor 6, CCR6)是CCL20 的特異性趨化因子受體。CCL20主要表現(xiàn)為對表達(dá)CCR6的未成熟樹突狀細(xì)胞以及記憶/效應(yīng)T細(xì)胞的趨化作用[2]。但它們在ANP 中的作用研究不多。本實(shí)驗(yàn)旨在探討CCL20和CCR6在ANP發(fā)病過程中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)分組及動物模型建立

健康雄性SD 大鼠48 只,清潔級,體重(250±30)g,由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。按完全隨機(jī)法分為ANP組和對照組，各24 只。采用膽胰管內(nèi)逆行注射4%牛磺膽酸鈉1 ml/kg體重的方法制備ANP模型；對照組同法注射等容積生理鹽水。術(shù)后1 、3 、6 、12 h分別隨機(jī)選取6只大鼠處死。抽血分離血清，-80℃保存；取胰頭部組織用10%中性甲醛固定，胰尾部組織立即置-80℃保存。

二、方法

1．血清淀粉酶測定：采用碘-淀粉比色法，由美國Vitros-250型全自動生化分析儀測定。

2．胰腺組織病理檢查及評分：甲醛固定的胰腺組織行病理檢查。由病理科醫(yī)師盲法讀片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野,參考Rongione等[3]的評分標(biāo)準(zhǔn)，從水腫、感染、出血和壞死4個(gè)方面評分,各項(xiàng)評分總和為最終分值。

3．CCL20和CCR6蛋白檢測：采用常規(guī)免疫組織化學(xué)方法。羊抗大鼠CCL20多克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司)1∶100，羊抗大鼠CCR6多克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司)1∶50,用TBS代替一抗作為陰性對照。

4．CCL20、CCR6 mRNA檢測：采用RT-PCR方法，試劑盒為南京天根生物技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。應(yīng)用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取胰腺組織總RNA,根據(jù)Genbank中基因序列自行設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程公司合成。CCL20引物序列為5′-CTGCTGGCTTACCTCTGC-3′和5′-ATTTCCTCCTTGGGCTGT-3′，產(chǎn)物298 bp；CCR6引物序列為5′-TCATCCCTTTGCTGTTTA-3′和5′-TCTGCCTGGAGATGTAGC-3′，產(chǎn)物411 bp；內(nèi)參GAPDH引物序列為5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′和5′-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3′，產(chǎn)物484 bp。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃ 3 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min ，30次循環(huán)，72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用圖像掃描儀測定光吸收值,以目的條帶與GAPDH條帶的光吸收值比為mRNA相對表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清淀粉酶變化

ANP組術(shù)后血淀粉酶水平較對照組明顯升高(P<0.01)，術(shù)后6 h達(dá)到高峰，術(shù)后12 h稍有下降 (圖1)。

圖1 ANP組和對照組血清淀粉酶變化

二、胰腺組織病理積分

ANP組術(shù)后1、3 h見胰腺小葉間明顯水腫,片狀出血,炎性細(xì)胞浸潤,腺泡細(xì)胞變性壞死;6、12 h小葉結(jié)構(gòu)破壞,大量腺泡細(xì)胞浸潤，大量炎性細(xì)胞壞死。ANP組胰腺病理評分明顯高于對照組(P<0.01，圖2)。

圖2 ANP組和對照組的胰腺組織病理學(xué)評分

三、CCL20和CCR6蛋白表達(dá)的變化

CCL20蛋白主要表達(dá)于胰腺腺泡細(xì)胞，CCR6蛋白表達(dá)于淋巴細(xì)胞和胰腺腺泡細(xì)胞，胰島細(xì)胞均不著色。對照組術(shù)后1、3 h見少量胰腺腺泡細(xì)胞有CCL20及CCR6蛋白弱表達(dá)，術(shù)后6、12 h腺泡細(xì)胞未見陽性表達(dá)(圖3a、b)。ANP 組術(shù)后1 h至6 h，CCL20蛋白陽性表達(dá)的腺泡細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，且細(xì)胞著色逐漸加深，術(shù)后12 h表達(dá)情況與術(shù)后6 h相似(圖3c)；術(shù)后3 h腺泡細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)可見較強(qiáng)的CCR6蛋白表達(dá)，術(shù)后6 h表達(dá)明顯增強(qiáng)，且細(xì)胞著色逐漸加深 (圖3d)，術(shù)后12 h CCR6蛋白表達(dá)較6 h減少。

a、b:對照組12 h CCL20、CCR6的蛋白表達(dá)(×200);c、d：ANP組12 h的CCL20和6 h的CCR6蛋白表達(dá)(×400 )

圖3兩組CCL20和CCR6蛋白表達(dá)(免疫組化)

四、CCL20 和CCR6 mRNA表達(dá)的變化

ANP組術(shù)后1、3、6、12 h胰腺組織CCL20 mRNA表達(dá)量分別為0.40±0.10、0.45±0.08、0.57±0.09、0.97±0.10，隨時(shí)間延長表達(dá)逐漸升高；對照組的CCL20 mRNA表達(dá)量分別為0.26±0.09、0.24±0.05、0.21±0.05、0.18±0.04。ANP組CCL20 mRNA表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01，圖4)。

1:Marker;2～5:對照組1、3、6、12 h;6～9:ANP組1、3、6、12 h

圖4兩組胰腺組織CCL20 mRNA的表達(dá)

ANP組術(shù)后1、3、6、12 h胰腺組織CCR6 mRNA表達(dá)量分別為0.28±0.05、0.76±0.08、0.88±0.05、0.37±0.10；對照組的CCR6 mRNA表達(dá)量分別為0.26±0.09、0.25±0.05、0.23±0.09、0.15±0.07。ANP組3 h和6 h的表達(dá)高于對照組(P<0.01)，12 h CCR6 mRNA表達(dá)較6 h下降，但仍較對照組顯著升高(P<0.05，圖5)。

1: Marker; 2～5:對照組1、3、6、12 h;6～9:ANP組1、3、6、12 h

圖5兩組胰腺組織CCR6 mRNA的表達(dá)

討 論

趨化性細(xì)胞因子是一組結(jié)構(gòu)相似的具有趨化功能的細(xì)胞因子，通過與靶細(xì)胞上相應(yīng)的受體相互作用而行使它們的各種功能。CCL20表達(dá)于多種細(xì)胞及組織類型，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種因子，廣泛參與生理及病理過程。CCL20和其受體CCR6相互作用，在炎癥局部發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞聚集和維持穩(wěn)態(tài)等作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ANP大鼠術(shù)后胰腺組織中CCL20 mRNA及蛋白的表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加，提示CCL20參與ANP大鼠胰腺組織的損害。Akahoshi等[4]研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞可在G+或G-菌的孵育下產(chǎn)生趨化因子。中性粒細(xì)胞可通過釋放趨化因子啟動抗原特異性免疫反應(yīng)，這些趨化因子可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞(DC)及T細(xì)胞的特異性聚集。Scapini等[5]認(rèn)為，中性粒細(xì)胞在脂多糖(LPS)或TNF-α的刺激下可以表達(dá)釋放CCL20。IL-10對LPS激活的中性粒細(xì)胞表達(dá)CCL20具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。激活的中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)上清液不僅使未成熟及成熟的DC產(chǎn)生趨化活性，還可激發(fā)快速整粘蛋白依賴的表達(dá)CCR6的淋巴細(xì)胞黏附于純化的VCAM-1和ICAM-1。這種黏附作用均可被抗CCL20抗體抑制，表明存在于上清液中的CCL20具有生物學(xué)活性。鑒于這些趨化因子主要對DC及特殊的淋巴細(xì)胞亞群具有趨化活性，中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的CCL20可使炎癥部位聚集的這些細(xì)胞的類型更加多元，并促成炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。Nakayama等[6]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠皮內(nèi)注射IL-α、TNF-α可迅速誘導(dǎo)CCL20在局部的積聚，其受體CCR6在數(shù)小時(shí)之后同樣隨之升高，推測在致病因素的作用下胰腺的腺泡細(xì)胞受損，引起大量細(xì)胞因子、趨化因子的釋放，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等在胰腺組織的聚集，隨后局部釋放大量炎癥介質(zhì)，在一些促炎癥因子如IL-1β、TNF-α作用下激活NF-κB ，從而引起CCL20在局部的積聚。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ANP大鼠術(shù)后CCR6 mRNA和蛋白表達(dá)在6 h內(nèi)明顯升高，且與胰腺組織病理損傷程度呈正相關(guān)。然而，術(shù)后12 h的CCR6表達(dá)較6 h減弱，考慮可能與ANP急性進(jìn)展期細(xì)胞免疫功能下降，T細(xì)胞數(shù)目相對減少或活性下降致CCR6表達(dá)減少有關(guān)。

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2009-08-14)

(本文編輯：屠振興)

ExpressionandroleofCCchemokineligand20andCCchemokinereceptor6inthepancreasofratswithacutenecrotizingpancreatitis

ZHOUGuo-xiong,ZHOUDe-xia,DINGXiao-ling,ZHANGHai-feng,ZHANGHong,CHENGJian-ping,QIANGHui,WEIQun,HUAGuo-ping．

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospital,NantongUniversity,Nantong226001,China

ZHOUGuo-xiong,Email：zhouguoxiong@medmail．com．cn

ObjectiveTo investigate the role of CC chemokine ligand 20 (CCL20) and CC chemokine receptor 6 (CCR6) in the pathogenesis of acute necrotizing pancreatitis (ANP).Methods48 SD rats were randomly divided into two groups: control group and ANP group. The ANP model was induced by retrograde infusion of 4 % sodium taurocholate into the biliary and pancreatic duct in SD rats. The same amount of saline was injected in the control group. The rats were sacrificed at 1, 3, 6, 12 h, the serum amylase levels and the pathological score of the pancreas were measured. The expressions of CCL20 and CCR6 mRNA and protein in pancreas were detected by immunohistochemistry and semi-quantitative RT-PCR, respectively.ResultsThe levels of serum amylase and the histological score of ANP group were significantly higher than those of control group (P<0.01). The expression of pancreatic CCL20 mRNA and protein was increased in a time-dependant manner (P<0.05). The expression of pancreatic CCR6 mRNA at 6h was significantly higher than that of control group (0.88±0.05vs0.23±0.09,P<0.01). The expression of pancreatic CCR6 mRNA at 12h was decreased when compared with that of 6h group, but it was still higher than that of control group (0.37±0.10vs0.15±0.07,P<0.05), the change of CCR6 protein was consistent with that of CCR6 mRNA.ConclusionsCCL20 and CCR6 may play an important role in the pathogenesis of ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Chemokines CC; Chemokine receptor

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.013

南通市社會發(fā)展基金資助項(xiàng)目(S5054)

226001 江蘇南通，南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化科

周國雄,Email:zhouguoxiong@medmail.com.cn