實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎豚鼠外周血單個核細(xì)胞分泌IL-4量的研究

瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(瀘州 646000)

呂志宇 李曉紅 榮本兵 李作孝*

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特點(diǎn)的自身免疫性疾病。實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎模型(Experimental allergic encephalomyelitis,EAE)與MS具有很多共同的特征,是國際公認(rèn)的MS動物模型[1]。研究認(rèn)為MS和EAE是由Th1介導(dǎo)的自身免疫性疾病,與Th1/Th2比例失衡有關(guān)[2]。本研究通過觀察EAE豚鼠發(fā)病的臨床癥狀、PBMC分泌 IL-4的量及兩者的相關(guān)性,探討Th2型細(xì)胞因子 IL-4在 EAE發(fā)病中的作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動物 雌性健康豚鼠 30只,體重250～300g;健康 SD大鼠 5只,體重200～250g。以上兩種動物均由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物科提供,都屬于一級合格動物。

2 藥物及主要試劑 IL-4 ELISA試劑盒,為晶美公司產(chǎn)品;淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077±0.002g/ml,)為上海君創(chuàng)生物科技有限公司產(chǎn)品;弗氏完全佐劑(含卡介苗 10mg/ml),為sigma公司產(chǎn)品。

3 方 法

3.1 免疫抗原制備:將大鼠處死后,迅速取出脊髓,用勻漿器制成50%(重量 /體積)的脊髓冰生理鹽水勻漿,后與等量的弗氏完全佐劑(卡介苗 10mg/ml)混合,用注射器抽打至油包水乳劑,制成粗制髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein,MBP)。用粗制 MBP抗原注入豚鼠后足掌皮下,每側(cè) 0.3ml制造 EAE模型。

3.2 實(shí)驗(yàn)分組、動物模型制備:將30只雌性豚鼠隨機(jī)分為3組并進(jìn)行編號:分別為正常對照組、EAE模型組及佐劑對照組,每組均為10只。

3.3 EAE豚鼠發(fā)病情況記錄及神經(jīng)功能障礙評分:豚鼠致敏后,每天同一時間(10∶00AM)對實(shí)驗(yàn)豚鼠進(jìn)行稱重并對各 EAE組豚鼠發(fā)病情況進(jìn)行記錄以及神經(jīng)功能障礙評分。神經(jīng)功能障礙評分標(biāo)準(zhǔn):0分:無明顯異常;1分:后肢不全癱瘓;2分:后肢完全癱瘓;3分:后肢全癱伴前肢不全癱;4分:四肢全癱或死亡。癥狀介于兩條標(biāo)準(zhǔn)之間者以±0.5分計(jì)。

3.4 實(shí)驗(yàn)終止:將四肢癱瘓、死亡或連續(xù)3d癥狀評分無加重時作為發(fā)病的高峰期,在發(fā)病高峰期處死動物;未發(fā)病的動物觀察4周后處死;正常對照組 4周后處死。

3.5 PBMC培養(yǎng)上清液 IL-4水平測定:取肝素抗凝的眶靜脈血用 Hanks液稀釋一倍,將其輕鋪在葡聚糖泛影蒲胺(Ficll-Urografin)分層液(比重1.077)上,然后用水平離心機(jī)離心單個核細(xì)胞懸于分層液上層。用毛吸吸管吸取單個核細(xì)胞層,加入Hanks液清洗、離心。加入含5%的小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞計(jì)數(shù) 2×105)。經(jīng)檢測活細(xì)胞比例均＞95%。取1ml調(diào)配完畢的細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)皿中,加入ConA(終含量為10μg/ml)放置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h以激活單個核細(xì)胞,收集上清液,-20℃保存。收集保存的上清液標(biāo)本于半月內(nèi)解凍,離心除去沉淀物。ELISA法檢測 IL-4含量,檢測按說明書方法進(jìn)行。

結(jié) 果

1 臨床癥狀:正常對照組及佐劑對照組均未發(fā)病,EAE模型組所有豚鼠均有發(fā)病,潛伏期為11.8±2.4d,進(jìn)展期為7.4±2.1d,高峰期神經(jīng)功能障礙評分為3.4±0.7分?；疾‰嗍蟊憩F(xiàn)為皮毛脫落、體重下降、肢體無力、自傷后肢,重者四肢癱瘓、抽搐、死亡。

2 各組豚鼠 PBMC分泌 IL-4的水平,見表1。EAE模型組豚鼠發(fā)病高峰期 PBMC分泌 IL-4的量較正常對照組顯著升高(P＜0.01);而佐劑對照組PBMC分泌 IL-4的量與正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組豚鼠 PBMC分泌 IL-4水平(±s)

表1 各組豚鼠 PBMC分泌 IL-4水平(±s)

注:與正常對照組比較,* P ＜0.01,△＞0.05;與EAE模型組比較,# P ＜0.01

EAE模型組 10 14.04±3.17*佐劑對照組 10 20.41±3.16△#F值 16.48 P值 ＜0.01

3 EAE模型組豚鼠 PBMC分泌 IL-4的量與發(fā)病潛伏期、進(jìn)展期、神經(jīng)功能障礙評分相關(guān)性分析,見表2。EAE模型組豚鼠 PBMC分泌IL-4的量與豚鼠發(fā)病潛伏期呈正相關(guān)(P＜0.05),而與發(fā)病進(jìn)展期及高峰期神經(jīng)功能障礙評分呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

表2 IL-4的水平與潛伏期、進(jìn)展期、神經(jīng)功能障礙評分相關(guān)性分析

討 論

EAE動物模型建立的關(guān)鍵因素是致敏抗原和敏感品系動物的選擇,本實(shí)驗(yàn)采用易致敏且在國內(nèi)易獲得的豚鼠作為致敏動物,用粗制 MBP作為抗原誘發(fā)EAE[3]。EAE模型在接種平均 12d后出現(xiàn)厭食、體重下降,不同程度的肢體癱瘓,且均表現(xiàn)為單病程發(fā)病。組織病理學(xué)變化主要為CNS白質(zhì)內(nèi)小血管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤。與經(jīng)典的EAE表現(xiàn)吻合,證明造模成功。

根據(jù)CD4+T細(xì)胞所產(chǎn)生細(xì)胞因子的種類,可將其分為Thl和Th2細(xì)胞。兩類細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子譜及其生物學(xué)功能均有所不同,Thl細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫,介導(dǎo)與細(xì)胞毒和遲發(fā)型超敏性反應(yīng)有關(guān)的應(yīng)答,故 Thl細(xì)胞亦稱為遲發(fā)型超敏性性 T細(xì)胞(TDTH細(xì)胞);Th2細(xì)胞主要功能是增強(qiáng) B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。Thl細(xì)胞主要分泌 IFN-α,IL-2、IL-12和TNF-α等促炎性細(xì)胞因子,Th2細(xì)胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等抗炎性細(xì)胞因子。Thl和Th2細(xì)胞可通過各自分泌的細(xì)胞因子彼此抑制。正常情況下,Thl和Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子處于動態(tài)平衡中,并受到機(jī)體的嚴(yán)格調(diào)控[4]。近年發(fā)現(xiàn),如果Th 1/Th2平衡發(fā)生偏離可導(dǎo)致一些自身免疫性疾病的發(fā)生[5,6]。

IL-4作為Th2細(xì)胞因子,能下調(diào) Th1型細(xì)胞活性,抑制 Th1型細(xì)胞因子如 IFN-γ的作用。給 NOD小鼠投以 IL-4可防止或延緩小鼠產(chǎn)生 Th1細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病型糖尿病,產(chǎn)生口服耐受和EAE恢復(fù)期的動物IL-4表達(dá)增強(qiáng)。因此IL-4可作為免疫調(diào)節(jié)因子抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng),治療EAE[7]。呂雪瑩[8]等人認(rèn)為在疾病的急性期免疫抑制因子 IL-4濃度低于正常水平,不能抑制 IFN-γ的促發(fā)和促進(jìn)的CNS自身免疫反應(yīng)及致炎性脫髓鞘作用。而 IL-4可能在恢復(fù)期起作用,通過其產(chǎn)生細(xì)胞Th2抑制Th1細(xì)胞的活化及炎性細(xì)胞因子的分泌,從而促使 EAE恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過對EAE豚鼠 PBMC培養(yǎng)上清液中具代表性的Th2類細(xì)胞因子 IL-4的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)病高峰期,EAE模型組PBMC分泌 IL-4的量比正常對照組顯著降低(P＜0.01),這說明 EAE豚鼠體內(nèi)存在著免疫失衡,IL-4在EAE的發(fā)病中扮演重要的角色。

本實(shí)驗(yàn)的Person相關(guān)分析顯示 EAE豚鼠 PBMC分泌的IL-4量與豚鼠發(fā)病的潛伏期呈正相關(guān),與發(fā)病的進(jìn)展期及神經(jīng)功能障礙評分呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。說明EAE豚鼠發(fā)病的嚴(yán)重程度與IL-4含量有相關(guān)性。

綜上所述,EAE豚鼠體內(nèi)存在免疫失衡,IL-4分泌量降低,且與發(fā)病的嚴(yán)重程度有相關(guān)性。檢測MS患者血清 IL-4含量對判斷疾病的活動性及嚴(yán)重程度有重要價值,可能對指導(dǎo) MS的新藥療效有重要的臨床價值。

[1] Render MP.The pathophysiology of acute experimental allergic encephalomyelitis in the rabbit[J].Brain,1994,107:699.

[2] Nakajima H,Fukuda K,Doi Y,etal.Expression of TH1/TH2-related chemokine receptors on peripheral T cells and correlation with clinical disease activity in patients with multiple sclerosis[J].Eur Neurol,2004,52(3):162-8.

[3] 榮本兵,李作孝.全脊髓勻漿建立豚鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊炎模型[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,30(2):104-106.

[4] 趙武述.免疫平衡研究及其臨床意義[M].北京:科學(xué)出版社,2005:100-101.

[5] Kidd P.Thl/Th2 Balance: The hypothesis,its limitations,and Implications for health and disease[J].Altern Med Rev,2003:8(3):223-246.

[6] 王良宏,肖林生.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血中 Vα24-Vβ11 NK T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)失調(diào)機(jī)制研究 [J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2008,37(7):773-775.

[7] Renno T.Cytokine production by cells in the cerebrospinal fluid during EAE in SJI/J mice[J].J Neuroimmunol,1994:49(1-2):1-7.

[8] 呂雪瑩,張鳳蘊(yùn),王麗群,等.實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎 IFN-γ及IL-4檢測 [J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1999,33(1):13-13.