Gli1小分子干擾RNA對(duì)人胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響Δ

瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(瀘州646000)

王 火亙 王忠瓊 杜光紅 夏國棟 鄧明明*

HH(Hedgehog)信號(hào)通路主要包括四個(gè)部分:HH信號(hào)肽、膜蛋白受體(Ptc)、核轉(zhuǎn)錄因子(Gli)、下游目的基因。越來越多的實(shí)驗(yàn)顯示,其異常激活能導(dǎo)致多種腫瘤生成,如皮膚基底癌、髓母細(xì)胞瘤、胰腺癌等[1～3]。本研究依據(jù) RNA干擾(RNA interference,RNAi)原理,設(shè)計(jì)并合成 Gli1基因特異性小干擾 RNA(smallinterfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染至胰腺癌PC-2細(xì)胞株,以探討 Gli1基因靶向性 siRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

材料和方法

1 材 料 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)C-2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所;3S Trizol總 RNA抽提試劑盒購自晶美公司;RT-PCR試劑盒購于北京天為時(shí)代公司;轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2 000購自 Invitrogen公司;Gli1抗體購自上海超研生物科技有限公司;Gli1引物及內(nèi)參 GADPH引物由上海生物工程有限公司合成,Gli1 siRNA轉(zhuǎn)錄模板由上海吉瑪公司合成。

2 方 法

2.1 Gli1 siRNA序列的設(shè)計(jì)和制備:根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Gli1基因(GeneBank編號(hào)NM005269)cDNA堿基序列,利用 Ambion公司提供的“siRNA Target Finder and Design Tools”設(shè)計(jì)針對(duì) Gli1的siRNA 2對(duì),經(jīng)Blast Search檢索確認(rèn)與Gli1以外的人類已知基因序列無同源性。序列如下:1#:sense: 5'-CTCCACAGG CATACAGGAT-3',antisense: 5'-ATCCTGTATGCCTGTGTGGAG-3';2#:sense:5'-AGC TCCAGTGAACACATAT-3',antisense: 5'-ATATGTGTTCACTGGAGCT-3'。熒光素特異性si RNA、單鏈oligonucleotides由上海吉瑪公司合成,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化。退火處理:兩條oligonucleotides各稀釋至1g/L,各取 2μl,加入退火緩沖液 46μl,90℃,5min,緩慢降至室溫,反應(yīng) 3h。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng):將人胰腺癌細(xì)胞株 PC-2細(xì)胞接種于含有 10%滅活胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%抗生素混合液的Mc Coy's 5A(購于Gi Bco公司)培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染:在 6孔板上每孔加入4×105個(gè)PC-2細(xì)胞,在無抗生素含血清培養(yǎng)液中孵育過夜,在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到30%～50%的融合度,使用PBS洗滌2次后,2對(duì)Gli1 si RNA以每孔10μl與250μl無血清培養(yǎng)液配制成混和液,以及7.5μl LipofectamineTM2000與250μl無血清培養(yǎng)液配制成混和液,兩種混和液分別于室溫下孵育 5min后混合,再于室溫下孵育 20min后加入無血清和抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)液中,6h后更換為全培養(yǎng)液,于孵育72h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。具體操作參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明。熒光素特異性 si RNA為陰性對(duì)照組,PBS液代替si RNA為空白組。

2.4 RT-PCR測定 Gli1 mRNA:轉(zhuǎn)染72h后分別收集 6孔板中各組細(xì)胞,使用常規(guī) RT-PCR法擴(kuò)增各組細(xì)胞中Gli1mRNA,Gli1上游引物:5′-GGGATGATCCCACATCC TCAGTC-3′下游引物:5’-CTGGAGCAGCCCCCCCAGT-3’,擴(kuò)增片段長度368bp。內(nèi)參 GAPDH的引物序列:上游引物:5′-CGAAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′下游引物:5′-AGCCTTCTCGGTGGTGAAGAC-3′,擴(kuò)增片段長度 209bp。PCR反應(yīng)循環(huán)條件為:94℃ 預(yù)變性 2min,94℃ 30s,51℃ 30s,72℃ 30s,30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min。③ PCR產(chǎn)物檢測:反應(yīng)結(jié)束后取10μl反應(yīng)物,20g/L瓊脂糖凝膠電泳,凝膠中加 0.5mg/L溴乙錠,緩沖液為0.5χTBE,5V/vm,45min,在反射紫外燈下觀察電泳帶,用數(shù)碼相機(jī)攝影并進(jìn)行光密度掃描分析,結(jié)果以產(chǎn)物與內(nèi)參對(duì)照的比值表示。

2.5 Western Blot檢測 Gli1蛋白表達(dá):收集空白對(duì)照、陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染Gli1 siRNA 72h的PC-2細(xì)胞1×105,用 PBS洗 2遍,溶解于裂解緩沖液(1mol/L Tris,p H 8.0的HCl2.5ml,NaCl0.438g,Triton-X-100 0.5ml,加蒸餾水至50ml。使用時(shí),0.87ml裂解液加入1.74/L PMSF50μl)提取總蛋白,每組分別取 20μg用以檢測內(nèi)參 GADPH蛋白質(zhì),取 60μg用以檢測 Gli1蛋白質(zhì),上樣經(jīng)10%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠,分別于90V恒壓電泳約 2h,60V恒壓電泳約90min,再于110V恒壓電泳1.5h后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上,隨后以 5%脫脂奶(5g脫脂奶粉溶于100ml 1×TBST溶液中)封閉過夜。用兔抗人 Gli1蛋白多克隆抗體(1∶1000)加在裝有NC膜的袋中室溫下?lián)u動(dòng) 2h雜交,洗膜后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔 Ig G(1∶2000)抗體,室溫下?lián)u動(dòng)1h。ECL顯色,暗室曝光X線片,膠片進(jìn)行拍照,記錄結(jié)果。同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參。

2.6 MTT檢測:取對(duì)數(shù)生長期的PC-2細(xì)胞以 1×104/孔接種于96孔板中常規(guī)培養(yǎng)24h后加上述處理因素,每組設(shè) 3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組,繼續(xù)培養(yǎng) 1～7d,每孔分別加入5g/L的MTT10μl,37℃下孵育4h后,每孔均加入10%SDS-Cl 100μl,輕微振蕩使紫蘭色沉淀溶解,用酶標(biāo)儀測定 490nm波長下的吸光度(A490值)。

2.7 TUNEL+PI雙染流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡:于轉(zhuǎn)染72h后,收集 1×106個(gè)細(xì)胞,于3.7%的福爾馬林中固定,然后加 Cytonin孵育,細(xì)胞打孔,接著加入Labeling Buffer混合物以及FITC熒光物質(zhì),最后加入PI復(fù)染進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

結(jié) 果

1 Gli1si RNA序列的選擇:Gli1siRNA轉(zhuǎn)染 72h后,空白對(duì)照、陰性對(duì)照和1#、2#Gli1 si RNA轉(zhuǎn)染組Gli1 mRNA水平分別為:0.723±0.028、0.718±0.025、0.705±0.023、0.235±0.018。1#Gli1 siRNA轉(zhuǎn)染組顯著低于2#Gli1siRNA轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照及陰性對(duì)照組(均 P＜0.01)(圖1),且 1#Gli1siRNA抑制Gli1mRNA作用更強(qiáng),故以其序列作為Gli1RNAi設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄模板。

圖1 Gli1 siRNA對(duì) Gli1 m RNA表達(dá)的影響

2 Gli1siRNA對(duì)于PC-2細(xì)胞 Gli1蛋白表達(dá)的抑制作用:使用 1#Gli1siRNA轉(zhuǎn)染 PC-2細(xì)胞 72h后,提取蛋白運(yùn)用 Western Blot法檢測 Gli1蛋白表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gli1蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照和陰性對(duì)照組(圖2),結(jié)果與RT-PCR一致。

3 干擾 Gli1表達(dá)后對(duì) PC-2增殖的影響:MTT法檢測各組細(xì)胞的A值,見附表。陰性對(duì)照 siRNA的胰腺癌細(xì)胞組與空白對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染后 24、48、72h和1周時(shí)細(xì)胞的增殖均未受影響(均P＞0.05)。轉(zhuǎn)染1#Gli1 siRNA的胰腺癌細(xì)胞與空白對(duì)照組相比,在 24h時(shí)細(xì)胞增殖未受到明顯影響,在轉(zhuǎn)染 48h后細(xì)胞增殖開始受到抑制,72h和1周時(shí)細(xì)胞增殖被明顯抑制(P＜0.05)。

圖2 Gli1 siRNA對(duì) Gli1蛋白表達(dá)的影響

附表 MTT法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞 A值(±s)

附表 MTT法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞 A值(±s)

注:與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較,*P＜0.05

72h 0.512±0.026 0.487±0.016 0.323±0.006*1周 0.667±0.012 0.623±0.008 0.233±0.019*

4 TUNEL+PI雙染流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡(圖3):空白和陰性對(duì)照組的細(xì)胞均呈現(xiàn) PI染色陽性,在488 nm波長的激發(fā)光下呈現(xiàn)明顯的黃色熒光,沒有見到明顯的FITC黃綠熒光。而 Gli1 si RNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞除了PI染色陽性的黃色熒光外,還表現(xiàn)出黃綠熒光,為FITC染色陽性,為凋亡細(xì)胞染色,表明轉(zhuǎn)染 Gli1 siRNA后的胰腺癌 PC-2細(xì)胞發(fā)生特異性凋亡。

圖3 TUNEL+PI雙染流式細(xì)胞檢測各組細(xì)胞凋亡

討 論

許多研究顯示,HH-Gli信號(hào)通路能直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖分化轉(zhuǎn)移的分子基因轉(zhuǎn)錄水平,該通路的作用模式為HH信號(hào)肽與膜受體Ptc蛋白分子結(jié)合后,解除了Ptc分子對(duì) Smo的抑制作用。Smo蛋白分子的激活可使 HH信號(hào)通路中核轉(zhuǎn)錄因子 Gli功能狀態(tài)發(fā)生改變,從而激活 HH信號(hào)通路下游目的基因轉(zhuǎn)錄。近來,對(duì) HH信號(hào)傳導(dǎo)通路與人胰腺癌之間的關(guān)系作了深入研究,我們的前期研究[4]及國外研究[5]均顯示 HH信號(hào)傳導(dǎo)通路中Shh、Smo、PTCH及Gli等的表達(dá)明顯高于臨近的正常組織,表明 HH信號(hào)途徑的激活和表達(dá)對(duì)人胰腺癌的發(fā)生和惡性生物學(xué)特性的維持極為重要。

Gli是一種鋅指核轉(zhuǎn)錄因子,在脊椎動(dòng)物中包括 3種核轉(zhuǎn)錄因子,即 Gli1、Gli2、Gli3,3種分子均含有相似的DNA結(jié)構(gòu)域-5個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),能與HH信號(hào)通路下游基因特定序列(GAC CAC CCA)結(jié)合而發(fā)揮作用,但 3種轉(zhuǎn)錄因子所起的作用是不一樣的,研究顯示[6],Gli1、Gli2主要起激活 HH下游基因轉(zhuǎn)錄功能,而 Gli3則起抑制作用,這可能是由于其 C、N末端存在不同的蛋白激活或抑制區(qū)域。Gli1只存在激活功能,與HH信號(hào)通路中下游基因的特定序列結(jié)合,直接調(diào)控 HH信號(hào)通路目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),在 HH信號(hào)通路調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其分子功能的改變直接導(dǎo)致 HH信號(hào)通路下游目的基因轉(zhuǎn)錄水平的改變,如調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖分化轉(zhuǎn)移的多種分子基因轉(zhuǎn)錄水平,如 CyclinD2、Bcl2、V EGF、Angiopoietin等基因[3,7]。體外細(xì)胞及小鼠腫瘤接種實(shí)驗(yàn)證實(shí)[8],利用 HH通路抑制劑如環(huán)杷明可抑制腫瘤細(xì)胞增殖,抑制瘤體增長,給人類治療腫瘤提供了新的策略。但此類抑制劑只能對(duì)由 HH信號(hào)通路上游基因變化導(dǎo)致異?；罨哪[瘤有作用。在Smo級(jí)聯(lián)反應(yīng)以下的一些參與HH信號(hào)通路調(diào)控的分子變化,如 SUFU基因突變將沒有治療意義[9]。而且,同種腫瘤與多種途徑導(dǎo)致 HH信號(hào)通路的異?；罨嘘P(guān),因此,理論上講,針對(duì) Gli干預(yù)治療有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值,因?yàn)榭梢詮母旧献钄?HH信號(hào)通路下游目的基因轉(zhuǎn)錄激活,從而抑制增殖、促進(jìn)凋亡,為治療腫瘤提供了新的途徑。為進(jìn)一步研究 Gli1基因在胰腺癌中的作用,本研究采用 RNAi技術(shù),以明確 Gli基因與胰腺癌的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn),設(shè)計(jì)的兩對(duì) Gli1si RNA中,1#Gli1 si RNA在轉(zhuǎn)染胰腺癌 PC-2細(xì)胞 72h后可以顯著抑制細(xì)胞 Gli1 m RNA和蛋白的表達(dá),說明 1#Gli1 siRNA對(duì)于胰腺癌細(xì)胞中 Gli的抑制作用特異而且完全。同時(shí),本研究將 1#Gli1 si RNA轉(zhuǎn)染 PC-2細(xì)胞后,應(yīng)用MTT法研究轉(zhuǎn)染后對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖情況的影響,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染48h后腫瘤細(xì)胞增殖開始受抑制,72h后腫瘤細(xì)胞的增殖明顯受抑,說明腫瘤細(xì)胞的增殖與Gli表達(dá)下調(diào)有關(guān)。同時(shí),本研究采用TUNEL+PI雙染流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡的方法檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡,發(fā)現(xiàn) 1#Gli1 siRNA轉(zhuǎn)染PC-2細(xì)胞后,腫瘤細(xì)胞的凋亡明顯增加,提示 Gli1 siRNA能顯著誘導(dǎo)胰腺癌腫瘤細(xì)胞的凋亡。我們的研究結(jié)果與Tsuda等[10]研究結(jié)果一致,表明 Gli1基因與胰腺癌密切相關(guān)。

綜上,Gli1基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用,采用 RNAi技術(shù)沉默 Gli1基因,能明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。抑制Gli1的表達(dá)有可能成為臨床治療胰腺癌的新靶點(diǎn)。

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