亞低溫對(duì)大鼠急性脊髓損傷后局部線粒體呼吸功能的影響

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院急診科(西安 710032)

趙 鵬 余厚友 王 肖 王慧賢 尹 文

近年來,亞低溫在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的保護(hù)方面的研究得到了大部分學(xué)者的認(rèn)同。亞低溫治療在急性脊髓損傷中的作用研究也正在起步,其治療機(jī)制也在逐步明晰。細(xì)胞活動(dòng)所需能量90%以上由線粒體氧化磷酸化提供。因此,外傷后線粒體呼吸功能的改變直接影響到神經(jīng)細(xì)胞的功能。本研究采用超速離心法分離出損傷段脊髓線粒體,觀察脊髓損傷后線粒體呼吸功能的變化及亞低溫對(duì)它的影響,并從亞細(xì)胞水平探討亞低溫治療對(duì)脊髓損傷后繼發(fā)性損害的病理生理演變過程的影響。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 SD大鼠 54只,雌性,體重220～260 g(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供),隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(A組,18只)、SCI組(B組,18只)、亞低溫組(C組,18只)。

2 SCI動(dòng)物模型制作 SCI組和亞低溫組參照改良的Allen’s法[1]制作大鼠脊髓中度損傷模型:實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食 8 h,用戊巴比妥鈉(30 g/L)按 40 mg/kg腹腔注射麻醉,背部脫毛后俯臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上,常規(guī)消毒,腰背部正中切口,逐層分開顯露 T8～T10椎板,行 T9全椎板切除,顯露硬脊膜,鉗夾固定 T8及T10棘突,用 50 g的不銹鋼棒(直徑為2.5 mm)沿帶有刻度的玻璃導(dǎo)管從 10 mm高處垂直下落,打擊在由塑料材料制成的底部呈凹面、直徑為3 mm的撞桿上,后者將打擊力傳遞給脊髓,造成大鼠脊髓不完全損傷,致傷后迅速移開打擊物,逐層縫合。模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn):打擊后損傷處脊髓出血、水腫,大鼠出現(xiàn)擺尾反射,雙下肢及軀體回縮樣撲動(dòng),麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。對(duì)照組僅行 T9全椎板切除術(shù)作對(duì)照。術(shù)后即刻腹腔注射5%葡萄糖鹽水2 ml,以補(bǔ)充血容量。術(shù)后處理:每只大鼠分籠飼養(yǎng),不限制進(jìn)食和飲水,術(shù)后定時(shí)協(xié)助損傷大鼠排尿、排便。

3 亞低溫治療 采用美國惠浦 HP-V26溫度測定儀連續(xù)監(jiān)測大鼠肛溫。模型建立成功后,亞低溫組大鼠體溫降至34℃左右。術(shù)前予全身烤燈加熱,使其溫度維持(37.5±0.2)℃。亞低溫治療組傷后5min內(nèi)立即使用腹部冰袋降溫法將大鼠肛溫降至(34±1)℃,烤燈+腹部冰袋降溫法維持亞低溫至治療所需時(shí)間(損傷后6h),然后室溫下自然復(fù)溫。

4 脊髓組織線粒體的提取 分別于損傷后 6、12和24 h三個(gè)時(shí)相點(diǎn)取材,每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只大鼠。根據(jù) Estabrook方法,各組在傷后相應(yīng)時(shí)段取出損傷段脊髓組織,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗脊髓組織,濾紙吸干后稱重。按16ml/g比例加入分離介質(zhì)至Teflon芯勻漿器中勻漿。然后將勻漿倒入預(yù)冷的離心管中,3000g離心 10min,取上清后配平,15000g離心 10min。棄去上清,沉淀部分再用分離介質(zhì)充分漂洗,15000g離心10min。棄去上清,沉淀中加入分離介質(zhì)0.5ml,充分打勻制成線粒體懸液約10mg/ml,置冰浴中待用。整個(gè)分離過程在冰浴中進(jìn)行,離心在0～4℃條件下進(jìn)行。

5 線粒體功能指標(biāo)的測定 采用Clark氧電極法[1],取反應(yīng)介質(zhì)(0.225mol/L蔗糖,15 mmol/L KCl,15 mmol/L KH2 PO4,50 mmol/L TrisHCl,1 mmol/L EDTA,p H 7.5)2.9 ml,加入攪拌反應(yīng)杯中,恒溫 30℃,加入線粒體懸液0.1 ml,以琥珀酸(終濃度10 mmol/L)為底物,反應(yīng) 1 min后,加入600nmol/L ADP,用 JYD-IA溶氧測定儀記錄線粒體氧化還原反應(yīng)曲線,計(jì)算 R3、R4、RCR和P/O。(測得的氧耗速率為氧化呼吸鏈呼吸Ⅲ(R3);ADP完全磷酸化后測得的氧耗速率為氧化呼吸鏈呼吸Ⅳ(R4),呼吸控制率(RCR)=R3/R4,磷氧比(P/O)=ADP量 /R3耗氧量)。

結(jié) 果

SCI組傷后 6、12、24 h的R3和RCR顯著低于對(duì)照組,R4顯著高于對(duì)照組,亞低溫組傷后 6、12h的R3和RCR高于SCI組,R4低于SCl組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);亞低溫組 R3、R4、RCR在傷后 6、12h和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。24 h時(shí)相 R3和RCR低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

線粒體的P/O直接反映了線粒體氧化磷酸化的變化,見附表。SCI組在傷后各時(shí)相總P/O明顯低于對(duì)照組,亞低溫組 P/O明顯高于SCI組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);傷后 6、12 h亞低溫組和對(duì)照組之間無明顯差異,但24 h仍低于對(duì)照組(P＜0.05)

附表 線粒體 R3、R4、RCR(%)和P/O變化 [nmol/(min· mg),(±s)]

附表 線粒體 R3、R4、RCR(%)和P/O變化 [nmol/(min· mg),(±s)]

與對(duì)照組比較,**P＜0.01;與SCI組比較,#P＜0.05,##P＜0.01

RCR 2.33±0.22** 2.64±0.27** 2.77±0.28**P/O 2.06±0.02** 1.76±0.04** 1.64±0.04**亞低溫組 R3 16.79±0.44## 16.43±0.57## 15.36±0.57##R4 5.19±0.19## 5.16±0.20## 5.23±0.19#RCR 3.25±0.18## 3.26±0.20## 2.30±0.20##P/O 2.43±0.02## 2.29±0.07## 2.21±0.05##

討 論

有研究報(bào)道腦創(chuàng)傷后 6～12 h線粒體呼吸活性R3、RCR、P/O和氧化磷酸化效率均明顯下降,R4相對(duì)正常或升高[3]。本實(shí)驗(yàn)中SCI組在傷后R3顯著低于對(duì)照組,同時(shí)R4顯著高于對(duì)照組,RCR、P/O明顯低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見附表。表明脊髓損傷后傷段脊髓線粒體內(nèi)膜底物通透性、呼吸鏈和ATP/ADP移位體等明顯受到影響。線粒體內(nèi)膜通透性增加。也說明損傷的線粒體 RCR的變化是由 R3降低和R4升高共同變化造成。線粒體氧化磷酸化偶聯(lián)程度明顯受到抑制,利用氧化釋放能量轉(zhuǎn)化為ATP的效率明顯降低。早期使用MP可明顯降低線粒體內(nèi)膜通透性,改善線粒體氧化磷酸化的偶聯(lián)程度,保護(hù)傷段脊髓線粒體的穩(wěn)定性。

本研究中亞低溫治療組在脊髓損傷傷后 6 h和12 h的R3明顯高于SCI組,R4明顯低于SCI組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;亞低溫組傷后6h和12h的RCR和P/O與對(duì)照組之間無明顯差異,但24 h仍低于對(duì)照組,見表一。說明傷后局部脊髓線粒體利用氧化釋放能量轉(zhuǎn)化為ATP的效率明顯降低。早期使用亞低溫治療可明顯減輕對(duì)線粒體內(nèi)膜底物通透性、呼吸鏈的影響,降低線粒體內(nèi)膜通透性,改善線粒體氧化磷酸化的偶聯(lián)程度和提高線粒體能量轉(zhuǎn)化的效率,對(duì)傷段脊髓線粒體的穩(wěn)定性和功能有一定的保護(hù)作用。

亞低溫對(duì)中樞神經(jīng)損傷保護(hù)的機(jī)理主要包括:降低腦組織氧耗量,減少腦組織乳酸堆積;保護(hù)血腦屏障,減輕腦水腫;抑制內(nèi)源性毒性產(chǎn)物對(duì)腦細(xì)胞的損害作用;減少鈣離子內(nèi)流,阻斷鈣對(duì)神經(jīng)元的毒性作用;改變遺傳信息的傳遞,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的恢復(fù),減少腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白破壞,促進(jìn)腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能修復(fù);減輕彌漫性軸索損傷;改變腦缺血后各種酶的活性,減輕缺血性神經(jīng)元損傷;調(diào)節(jié)損傷后鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶的活性,促進(jìn)缺血再灌注后期蛋白質(zhì)的合成;抑制神經(jīng)元凋亡;抑制腦損傷缺血缺氧后的炎性反應(yīng)[7～9]。實(shí)驗(yàn)表明線粒體有攝取、積聚二價(jià)陽離子如 Ca2+、Mg2+等作用,調(diào)節(jié)胞漿游離 Ca2+的濃度,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的釋放反應(yīng)、受體調(diào)節(jié)、信息傳遞。研究表明細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi) Ca2+超載是脊髓損傷后線粒體功能障礙、結(jié)構(gòu)受損的重要原因 。在顱腦損傷中的研究結(jié)果表明,亞低溫治療能減少腦組織Ca2+內(nèi)流,從而降低磷脂酶活性,使線粒體膜結(jié)構(gòu)保持完整性,又使自由基形成減少。本實(shí)驗(yàn)顯示:SCI組 R3、RCR、P/O與對(duì)照組相比明顯下降,R4明顯上升,亞低溫治療組 RCR和P/O比值高于SCI組,表明亞低溫治療能改善損傷脊髓線粒體氧化磷酸化功能,改善線粒體呼吸功能,從而證實(shí)亞低溫在脊髓水平也能起到相似作用。

近年來,隨著亞低溫腦保護(hù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用上的成功,有關(guān)亞低溫治療脊髓損傷的研究和臨床應(yīng)用也相繼開展。本實(shí)驗(yàn)從亞細(xì)胞水平提示,使用亞低溫治療,可提高傷段脊髓線粒體的呼吸功能,對(duì)脊髓損傷有一定的保護(hù)作用,筆者希望此方面的研究將會(huì)為今后亞低溫脊髓保護(hù)工作的開展提供一定的理論依據(jù)。

[1] Estabrook RW.Oxidative and phosphorylation methods in enzymology.new york:Academic Press,2005,(10):45.

[2] Vink R,Golding EM,Headrick JP.Bioenergetic analysis 0f oxidative metabolism following traumatic brain injury in rats[J].Neurotranata,1994,11(3):265-268.

[3] Uu D,U L.Prostaglandin re1ease by spinal cord injury mediates production 0f hydroxyl radical,malondiadehyde and ce11 death:a site of neuroprotective action of methylpredinsolone[J].Neurotraunsm,2001,77(4):1036-1047.

[4] Mckenzie AL,Hall JJ,Aihara N,et al.Immunolocalization of endothelin in the tmumatized spinal cord:relationship to blood spinal cord barrier breakdown[J].JNeurotrauma,1995,12(3):257-268.

[5] Salzman SK,Aeosta R,Beck G,etal.Spinal endothelin content is elevated after moderatelocal trauma in the rat to levels associated with locomotor dysfunction .intrathecal injection[J].JNeurotrama,1996,13(1):93-101.

[6] Holmin S,Mathiesen T.Intracerebral administration of interleukin-1 beta and induction of inflammation,apoptosis,and vasogenic edema[J].JNeuro Surg,2000,92(1):108-l20.

[7] Oudega M,Vargas CG,Bunge MB.Long-term effects of methylprednisolone following transection of adult rat spinal cord[J].Eur JNeurosci,1999,11(7):2453-2464.

[8] 只達(dá)石.亞低溫腦保護(hù)的發(fā)展和現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志,2002,2(3):133-135.

[9] Harris OA,Coford MJ,Good M C,etal.The role of hypothermia in the management of severe brain injury[J].Are Neurol,2002,59(7):1077-1088.

[10] Khan T,Havey R M,Sayers S T,etal.Animal models of spinal cord contusion injuries[J].Lab Anim Sci,1999,49:161-172.

[11] 郭亞樂.缺氧缺血性腦損害亞低溫干預(yù)持續(xù)時(shí)間的選擇[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2003,32(1):92.