白藜蘆醇對裸鼠移植性肝癌的抑制作用△

陜西省人民醫(yī)院肝膽外科(西安 710068)

孫中杰 余海波 張 煜 劉曉剛 杜立學

白藜蘆醇(Resveratrol,Res)具有降血脂、清除氧自由基、調節(jié)機體免疫力、抗腫瘤作用。它對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展多階段均有明顯的抑制效果。Whitsett等[1]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以顯著降低小鼠乳腺癌的發(fā)生率,Res能抑制小鼠肝癌細胞 H22的生長[2]。在本實驗中我們通過構建人肝癌細胞系 Hep G2裸鼠皮下移植瘤的模型,觀察白藜蘆醇對移植瘤的抑制作用。

材料和方法

1 實驗材料 白藜蘆醇Sigma公司產品,CD34單抗 Zymed公司產品;人肝癌 Hep G2細胞,西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科實驗室傳代保存;BALB/c(nu/nu)雄性裸小鼠由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供,雄性,6周齡,體重18～22g,在該中心 SPF級(Specific pathogen free)環(huán)境中飼養(yǎng)。

2 方 法

2.1 白藜蘆醇對裸鼠移植性肝癌的抑制作用:18只接種人肝癌細胞 Hep G2移植瘤裸鼠模型隨機分為3組,每組 6只:50mg/kg Res組,生理鹽水(NS)對照組,1%DMSO對照組。接種后第10天開始,每間隔2天腹腔給藥 1次,每只裸鼠腹腔注射大約 0.2～0.3ml,共注射10次。觀測指標:①腫瘤體積:每次給藥前以游標卡尺測量皮下腫瘤直徑,以腫瘤最大徑與腫瘤最小徑乘積(mm2)代表腫瘤大小。②腫瘤重量:末次給藥 24h后,脫椎處死裸鼠,解剖摘除皮下移植瘤,盡量剝離移植瘤表面包膜,分析天平稱重。

2.2 測定腫瘤微血管密度(Microvessel density,MVD):瘤組織切片經二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化;0.3% H2O2-甲醇溶液室溫下浸泡后,經微波修復抗原,以 10%山羊血清封閉切片,排除組織和一抗發(fā)生非特異性結合。按步驟先后滴加 1∶50稀釋的CD34一抗、生物素化二抗和SABC液,用磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對照;滴加新鮮 DAB顯色液至切片,避光顯色后終止反應;梯度乙醇逐級脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,光鏡下觀察并攝影。對各組裸鼠腫瘤組織CD34染色切片進行MVD計數(shù):染成棕色的血管內皮細胞或血管內皮細胞群,只要它們與鄰近微血管、腫瘤細胞或其它結締組織分開,就視為一個微血管,同一個血管的“頭”和“尾”正好在一個切面上,也作為兩個微血管計算,血管腔和紅細胞不作為判斷血管的標準。先在100倍視野下觀察整張切片的血管分布情況,確定腫瘤區(qū)域內微血管最密集的5個區(qū)域,即“熱點”。再在200倍光鏡下計數(shù)每個區(qū)域內的血管數(shù),取 5個區(qū)域的平均值,作為該只裸鼠腫瘤的MVD。

2.3 統(tǒng)計學分析:全部數(shù)據經SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用方差分析并行兩兩比較,以 P＜0.05作為具有顯著性差異的標準。

結 果

1 Res對裸鼠移植瘤瘤體大小的影響:在移植瘤生長的早期階段(前 2周),50mg/kg Res組裸鼠移植瘤瘤體與DMSO組及NS組裸鼠比較并無明顯差別;2周后移植瘤開始進入快速生長期,開始出現(xiàn)差別,到24d時,50mg/kg Res組處理組裸鼠瘤體明顯小于NS組(P＜0.05);DMSO組與NS組比較前者的瘤體較小,但沒有統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 Res對裸鼠移植瘤瘤體大小的影響

2 Res對裸鼠移植瘤瘤體重量的影響:50mg/kg Res組瘤體重量明顯較 NS組輕,有顯著差異(P＜0.01);0.1%DMSO組及NS組瘤體重量無明顯差異,無統(tǒng)計學意義(P=0.51)(圖2)。

圖2 Res對裸鼠移植瘤瘤體重量的影響

3 Res對 Hep G2細胞裸鼠移植瘤組織中 MVD的影響及其與腫瘤體積的相關性:免疫組化結果顯示,50mg/kg Res處理組 MVD為18.5±3.2,且呈棕褐色條索狀,微血管分布較稀疏,與生理鹽水對照組的MVD值(44.2±4.1)相比明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),表明 Res具有抗 Hep G2細胞裸鼠移植瘤血管生成的作用。經 Res作用后,裸鼠移植瘤組織中MVD明顯減少的同時腫瘤體積亦明顯減小,經統(tǒng)計學分析,移植瘤組織MVD與相對腫瘤體積呈明顯正相關(r=0.715,t=4.797,P＜0.01)。

討 論

腫瘤的治療是一個世界性難題,尋找高效、低毒的抗癌藥物是目前研究的重要課題之一。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有心血管保護作用,對多種腫瘤均有抑制作用,可以抑制小鼠皮膚癌[3],人乳腺上皮癌[4],前列腺癌[5]的生長增殖,能誘導人白血病細胞 HL-60細胞的分化[6]。最近還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可抑制小鼠肺癌(LLC)移植瘤的生長、轉移,2.5～10mg/kg的白藜蘆醇可以使腫瘤體積減少 42%,重量減少 44%,肺轉移下降56%[7]。前期的實驗發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在體外能抑制Hep G2細胞的增殖,本研究發(fā)現(xiàn) 50mg/kg Res用藥兩周后,瘤體大小較對照組為小,顯示出 Res對裸鼠移植瘤亦有抑制作用;移植瘤裸鼠觀察結束時瘤體重量的改變,更加說明了Res按 50mg/kg給藥對裸鼠移植瘤生長具有較明確的抑制效應。這與Res抑制其它腫瘤的研究結果相似[2]。因為Res是疏水性物質,不易溶于水,因此我們加用了助溶劑 DMSO助溶并作對照。在實驗中,我們發(fā)現(xiàn) 0.1%DMSO組與NS組瘤體大小比較差異不明顯,沒有統(tǒng)計意義。

腫瘤血管生成是指血管內皮細胞從現(xiàn)有的血管系統(tǒng)中分化、遷移而形成新的微血管的復雜生物學過程,有多種生長因子、胞外基質成分、蛋白水解酶和細胞粘附分子參與此過程[8]。惡性腫瘤發(fā)生侵襲和轉移是腫瘤治療失敗的主要原因[9],而腫瘤血管生成在其轉移的起始及終末階段發(fā)揮著重要作用[10]。血管新生和豐富的血流是腫瘤迅速生長和發(fā)生轉移的病理基礎和重要條件。故如何抑制早期血管生成、破壞腫瘤血管已經成為腫瘤治療研究的熱點和突破口。有研究表明,對腫瘤組織中已經存在的血管和/或正在血管生成的腫瘤進行干預,阻斷誘導血管生成的通路,能夠有效地抑制腫瘤增殖和生長,使其處于休眠狀態(tài)[11]。近年來研究表明,血管生成是包括 HCC在內的許多實體瘤生長和轉移的關鍵因素[12]。目前認為腫瘤組織 MVD作為間接測量腫瘤血管生成的一項指標,與多種腫瘤臨床分期、病理分級、淋巴結轉移,以及患者預后有關[13]。前期的實驗發(fā)現(xiàn) Res能下調 Hep G2細胞 VEGF m RNA及蛋白的表達,本研究發(fā)現(xiàn)經 Res處理的腫瘤比生理鹽水組腫瘤蒼白,這可能與其抑制了腫瘤血管生成有關。進一步檢測裸鼠移植瘤組織MVD發(fā)現(xiàn),Res能夠明顯降低裸鼠皮下移植性肝癌組織MVD,且肝癌組織MVD與裸鼠相對腫瘤體積呈正相關。這提示Res可以抑制腫瘤組織中的新生血管的形成,降低腫瘤組織MVD,遏制腫瘤生長。Res可能具有抑制肝癌細胞生長及侵襲轉移的作用。

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