黃芪甲甙干預小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡的研究△

南華大學附屬第一醫(yī)院(衡陽 421001)

劉丹莉 楊云華 于小華 李雙杰

組織工程和基因工程技術發(fā)展而來的細胞替代治療和基因治療是近年來醫(yī)學領域乃至整個生命科學領域中的研究熱點和前沿,為人類征服多種疾病提供了新的途徑和希望。近年來,細胞心肌移植術作為一種新的治療心衰的方法顯示出其重要性,其理論基礎就是通過新的細胞修復受損區(qū)域來改善心功能[1]。近 10年來,骨髓間充質(zhì)干細胞作為組織工程細胞成為研究的熱點,但研究大多集中于對骨髓間充質(zhì)干細胞的誘導分化上,而對移植后細胞的存活情況的研究很少,由于移植后細胞生存率的高低直接影響到治療效果,故如何提高骨髓間充質(zhì)干細胞的存活率,是目前亟待解決的問題。本試驗通過研究黃芪甲甙對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖與凋亡的影響,以求進—步提高移植后 BMSCs的存活率,從而提高治療效果。

材料與方法

1 材料選擇

1.1 動物:純種近系 Balb/c小鼠(批號:SCYK滬2002-0002),4周齡,雄性,SPF級,體重12～16g,購買于復旦大學動物實驗科學部。

1.2 試劑:L-DMEM培養(yǎng)基、胰酶(GIBICO);胎牛血清(天津顥洋公司產(chǎn)品);MTT、DMSO(Sigma公司);一抗 CD34、CD44、淋巴細胞分離液(Santa cruz公司);二抗 FITC-Goat Anti-Mouse IgG(武漢博士德公司);TUNEL試劑盒為美國 Rouse公司)。

1.3 倒置相差顯微鏡(日本 Olympus公司),熒光顯微鏡(美國 Nikon公司),流式細胞儀(COULTER EPICS ALTRA Hyper Sert TM System,美國)。

1.4 黃芪甲甙(批號:0781-9706)由國家藥物和生物制品檢定研究所(NICPBP)提供,為白色干粉劑,不溶于水,用助溶劑羧甲基纖維素鈉制成均勻混懸液。

2 方 法

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)及鑒定

2.1.1 選健康 4周齡雄性 Balb/c小鼠,體重12～16g,斷頸法處死后75%乙醇浸泡殺菌 5min;無菌取股骨和脛骨(必須把肌肉剔除干凈),用骨剪剪斷兩端關節(jié)處,注意保留骨端部分不受損傷。用一次性5號注射器吸取無血清 DMEM向無菌培養(yǎng)皿中沖洗出骨髓腔干細胞。用10ml離心管收集沖出的細胞,離心1000轉(zhuǎn)/min、5min,棄上清液。向沉淀中加含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液4ml,用吸管輕輕吹打吹散細胞,把細胞移入50ml培養(yǎng)瓶中,并用吸管輕輕吹散細胞,輕輕搖勻,標記為原代細胞,置 37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行原代細胞培養(yǎng),并于接種細胞后 48h時倒掉細胞懸浮液,再加入4m1培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。于接種細胞5d時首次換液,以后每周換液兩次,待細胞接近融合時,胰蛋白酶消化,1∶2傳代,標記為第一代(Passage l,P1),倒置顯微鏡逐日觀察,待細胞鋪滿瓶底時,重復上述操作,反復傳代擴增,并標記為P2～P5等。由于細胞貼壁性能不同,每次換液傳代0.25%胰蛋白酶(1～2ml)消化2～3min,嚴格控制酶的量和消化時間,將 BMSCs與可能混雜的淋巴細胞、單核細胞分開,從而使 BMSCs得到純化。

2.2 骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定

2.2.1 免疫熒光法鑒定:取生長良好的P8代細胞,消化,以1×104/ml接種細胞于預置三個蓋玻片的6孔板中使細胞爬片,放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),逐日觀察,待細胞長滿玻片時,取出玻片,80%冷丙酮固定,0.5%Tri 2tor 2×100破膜,3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶,正常山羊血清封閉,分別加一抗(小鼠抗大鼠 CD44、CD34,PBS作為陰性對照組),室溫孵育過夜后,PBS沖 3遍,以洗去未結(jié)合的一抗,加熒光標記二抗,避光置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應1h后置熒光顯微鏡下觀察。

2.2.2 流式細胞儀分析:取三瓶生長良好的P9代骨髓間充質(zhì)干細胞,0.25g%的胰酶消化后,收集細胞離心1000轉(zhuǎn) /min、7min,棄去上清液,加入PBS沖洗再離心同上,棄去上清液,分別加入加入稀釋的CD34、CD44一抗,PBS作為陰性對照,4℃孵育 30min,流式儀檢測細胞表面抗原 CD34、CD44。

2.3 細胞增殖分析采用M TT法:0.25%胰酶消化體外增殖 BMSCs并計數(shù),再將 200μl密度為1×107～108個/L BMSCs均勻接種到包被有明膠的96孔培養(yǎng)板,共分三個時間點(12h,24h,48h)和6個濃度組:空白對照組,10μg/L阿霉素組(ADR),ADR+AST(4μg/L,40μg/L,400μg/L)組,400μg/L黃芪甲甙組(AST組)(n=3)。分別培養(yǎng) 12h、24h、48h后每孔加10μl MTT(5μg/ml),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 4h后,吸棄上清液,再加入二甲基亞砜(150μl/孔),于微量振蕩器充分振蕩10min,置酶標儀于波長490nm處測吸光度(Optical density,OD)值。

2.4 骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡檢測

2.4.1 流式細胞儀:FITC單染色法檢測早期凋亡細胞:取生長良好的P9代BMSCs細胞,實驗分6組,空白組、阿霉素組(10μg/L),阿霉素(10μg/L)加低(4μg/L)、中(40μg/L)、高(400μg/L)濃度黃芪甲甙組,黃芪甲甙(400μg/L)組,分別向培養(yǎng)瓶中加入上述不同濃度的藥物,作用 24h后收集細胞,上機檢測。同樣操作重復 3次。

2.4.2 TUNEL法檢測:光鏡下細胞被染成棕褐色者為陽性細胞,即凋亡細胞。

結(jié) 果

1 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)及鑒定:原代細胞于接種后約24h,大部分細胞貼壁,倒掉懸浮生長的細胞,貼壁細胞繼而分裂增殖,呈集落式生長,集落不斷增多、擴大、互相融合,約 10～14d鋪滿瓶底,有漂浮不貼壁細胞呈囚形或橢圓形,隨傳代次數(shù)增多,夾雜至原代末期的非BMSC會逐漸被洗去。傳代細胞很快貼壁,增殖迅速,約 6～7d長滿瓶底,呈梭形均勻分布。多次傳代,細胞有更均勻有序的成纖維細胞樣分布。連續(xù)傳 5代,細胞形態(tài)無明顯變化,無衰老征象,傳代周期 6～7d,說明 BMSCs得到了進一步的純化。

2 流式細胞術鑒定:流式細胞術鑒定 CD44陽性率為(78±5.34)%,CD34陽性率約為(29±3.13)%,說明P3代細胞還不是很純。

3 細胞凋亡的檢測

3.1 流式細胞術檢測早期細胞凋亡:流式細胞儀檢測不同濃度、不同時間細胞凋亡率,見圖1。

圖1 不同濃度組流式細胞術檢測細胞凋亡條形圖

圖中 48h組通過流式細胞術檢測阿霉素組明顯的凋亡峰,黃芪甲甙組凋亡峰明顯下降。通過統(tǒng)計學方法分析,48h組,阿霉素組與ADR+AST40μg/L、ADR+AST400μg/L組凋亡率比較均有顯著性差異(P＜0.01),與ADR+AST4μg/L組比較無顯著性差異。對于ADR+AST40μg/L組,48h組 OD值與12h、24h組比較均有顯著性差異(P＜0.01或0.05),12h和24h組無顯著性差異,隨著黃芪甲甙濃度的增大,作用時間的延長,對骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡的抑制作用越強。

3.2 TUNEL法檢測:TUNEL法檢測不同濃度、不同時間細胞凋亡率值,見表1及TUNEL檢測細胞凋亡曲線圖。

表1 TUNEL法檢測不同濃度、不同時間細胞凋亡率值(±s)

表1 TUNEL法檢測不同濃度、不同時間細胞凋亡率值(±s)

ADR+AST40μg/L 28.1900±0.5806 26.145±1.5347 23.345±1.0156 ADR+AST400μg/L 27.5350±0.8070 26.4050±1.9722 23.3350±2.5969 AST400μg/L 2.2900±0.2255 3.4125±0.1793 4.9775±0.6061

表1中 48h組,阿霉素組與ADR+AST40μg/L、ADR+AST400μg/L組凋亡率比較均有顯著性差異(P＜0.01),與ADR+AST4μg/L組無顯著性差異。對于ADR+AST40μg/L組,48h組 OD值與12h、24h組比較均有顯著性差異(P＜0.01或 0.05),而 12h組與24h組差異無顯著性,隨著黃芪甲甙濃度的增大,作用時間的延長,對骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡的抑制作用越強。

圖2 TUNEL檢測細胞凋亡曲線圖

圖2中 1、2、3、4、5、6代表含義同圖1,由圖可看出,隨著黃芪甲甙濃度的增加及藥物作用時間的延長,細胞凋亡率呈逐漸下降的趨勢。

討 論

細胞心肌移植術是通過向受損心肌補充肌源性細胞,從而改善心功能的細胞治療方法。異基因造血干細胞移植是許多疾病目前治療的有效手段,目前靶細胞選擇從具有免疫排斥和倫理問題的胚胎心肌細胞轉(zhuǎn)向成體自身組織來源,如骨骼肌衛(wèi)星細胞,但后者不能形成有效閏盤連接且取材繁瑣使其應用受限。間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是中胚層的干細胞,理論上可以分化發(fā)育成中胚層所有組織類型的細胞,也可以存在于所有中胚層來源的組織中[2]。具有多向分化潛能的干細胞。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是各種間質(zhì)細胞的前體細胞,具有很強的增殖能力和多向分化潛能。它可以向多種結(jié)締組織分化,形成骨、軟骨、骨骼肌腱、真皮及神經(jīng)細胞、心肌細胞等[3,4]。BMSCs是已知成體內(nèi)分布范圍最廣,分化方向最多的干細胞,還具有取材方便、擴增容易,進入機體后可全身分布,應用自體細胞沒有免疫排斥和倫理問題,外源基因表達穩(wěn)定,是細胞治療和基因治療的良好種子 /載體細胞。已經(jīng)成為繼造血干細胞后第 2個用于臨床的干細胞,具有很重要的臨床應用價值[5,6]。BMSCs離體實驗在 5-氮雜胞苷類(5-Azacytidine,5-aza-CR)物質(zhì)誘導下,能向心肌細胞分化[2,3]。在體實驗也顯示在心肌局部微環(huán)境誘導下,BMSCs能向心肌細胞分化,并改善受損心臟功能[7]。實驗證實BM SCs移植入心臟后,可在移植部位檢測到標記的BMSCs細胞,其c TnT染色陽性,從而證實了BMSCs能在這種非缺血微環(huán)境中向心肌細胞分化。干細胞心肌移植時,心肌內(nèi)每點注射的細胞數(shù)量有限,并且移植細胞的存活率不高;增加移植細胞的數(shù)量和提高其存活率對心功能的改善更有利。如何提高移植后干細胞的存活率是當前干細胞移植治療心血管疾病的丞待解決的問題。由于干細胞本身以及其分化的子代細胞的存活、生長需要合適的微環(huán)境,當干細胞或培養(yǎng)干細胞植入損傷的心臟后,由于周圍組織缺血缺氧,環(huán)境惡劣,移植的大部分干細胞并不能夠存活,大約有99%左右的細胞會死亡,這—問題大大降低了干細胞在心肌損傷修復中的效果。因此,提高移植后細胞的存活率是干細胞用于心肌修復治療的一個關鍵。目前已有研究證實通過基因?qū)毎M行修飾可以提高其移植后的生存率,如Margi等將akt基因?qū)牍撬栝g質(zhì)干細胞后移植損傷心臟,該策略能夠明顯提高干細胞存活率,并使心功能獲得明顯的改善[8]。那么選擇有效的能抑制干細胞凋亡促進其增殖的藥物對干細胞進行干預,可能也是提高細胞的移植存活率和治療效果的—條有效途徑。

研究表明,黃芪甲甙對病毒性心肌炎有良好的治療作用[9,10]。近年來有研究表明,黃芪甲甙制劑可刺激造血干細胞由靜止期進入增殖期,刺激其分化,還可刺激基質(zhì)細胞分泌某些細胞生長因子,從而促進造血干細胞的增殖。促進增殖的機理可能是通過保護和改善骨髓造血微環(huán)境,并通過促進基質(zhì)細胞的生長和增殖,進而促進造血干細胞的增殖[11]。ADR是臨床上常用的抗腫瘤化療藥,其最嚴重的副作用是導致心衰和心肌病的產(chǎn)生,通過這種藥物,目前已經(jīng)建立了多種動物心肌病和心衰模型[12]。本試驗通過阿霉素對BMSC誘導凋亡,再加入黃芪甲甙進行干預,觀察不同組別間細胞增殖與凋亡的情況,結(jié)果顯示黃芪甲甙 40μg/L組凋亡率為(23.04±1.12)%,和單純 ADR組凋亡率(40.42±2.28)%相比,差異有顯著性,說明黃芪甲甙具有抑制 BMSC凋亡的作用,和400μg/L組凋亡率(21.85±1.21)%比,差異無顯著性,說明黃芪甲甙對 BMSC的凋亡作用不是劑量依賴性,而是具有最適濃度,本試驗顯示為40μg/L具有較強的抑制凋亡的作用。實驗結(jié)果為中藥黃芪甲甙應用于BMSCs移植治療心血管疾病提供動物實驗依據(jù)。

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