斜紋夜蛾幼蟲腸道不同部位對 Zn2+積累作用的比較研究

舒迎花,袁才亞,張古忍

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶亞熱帶生態(tài)研究所,廣州 510642;2.中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/昆蟲學(xué)研究所,廣州 510275;3.深圳市龍崗區(qū)實(shí)驗(yàn)學(xué)校,深圳 518172)

昆蟲腸道是攝取、運(yùn)送、消化食物、吸收營養(yǎng)物質(zhì)以及控制水分平衡和排泌作用的重要通道,可分為前、中和后腸三個(gè)部位。前腸具有攝食、磨碎和暫時(shí)貯藏食物的功能;中腸是分泌各種消化酶、消化食物及吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要部位;后腸除了排泄食物殘?jiān)痛x廢物之外,還有吸回水分和無機(jī)鹽類、調(diào)節(jié)血液滲透壓和離子平衡的功能。

由于腸道各段結(jié)構(gòu)和功能的不同,它們對食物中重金屬離子的積累作用必然存在差異。有報(bào)道表明中腸是很多昆蟲種類金屬離子吸收和調(diào)節(jié)平衡的主要通道,如彈尾目、纓尾目、鞘翅目、同翅目、毛翅目、鱗翅目、膜翅目和雙翅目等(Hensbergen,2000;Niu et al.,2002)。Devkota和 Schmidt(1992)用含 Hg的飼料飼養(yǎng)綠紋蝗 Aiolopus thalassinus Fabricius,發(fā)現(xiàn)汞 Hg在中腸中的含量最高。家蠅 Musca domestica L中腸是積累砷 As的主要器官,其含量是身體的 6～107倍,身體 15% ～71%的 As都積累在中腸中(Thomas et al.,1987)。家蠅體內(nèi)的重金屬主要儲存在腹部,變態(tài)后重金屬會隨中腸的重建回到中腸上皮細(xì)胞中(Tylko et al.,2005)。彈尾目昆蟲長角跳蟲 Orchesella cincta L經(jīng) Cd脅迫后,中腸的 Cd吸收量會顯著增加(Posthuma et al.,1992)。更有研究提議由于昆蟲中腸是調(diào)節(jié)金屬平衡和儲存金屬的最重要的器官,所以其上皮細(xì)胞的改變可以作為重金屬污染的檢測標(biāo)記(Pawert et al.,1996)。相對于昆蟲中腸,重金屬在陸生昆蟲前腸、后腸積累特點(diǎn)的研究還未見報(bào)道。

生活在陸地環(huán)境中的昆蟲主要通過呼吸和攝食而受到重金屬污染的影響 (Heli?vaara and V?is?nen,1993)。在自然條件下,斜紋夜蛾 Spodoptera litura Fabricius是一種分布廣泛的鱗翅目植食性害蟲,其幼蟲主要取食莊稼如棉花、大豆、花生、土豆和十字花科蔬菜,老熟幼蟲鉆進(jìn)土壤中化蛹,在土壤經(jīng)過化蛹期,羽化變成蛾,不再取食(Etman and Hooper,1979;Matsuura and Naito,1997;Qin et al.,2004)。土壤中的重金屬主要通過植物的吸收作用進(jìn)入斜紋夜蛾幼蟲的食物中而對其產(chǎn)生影響。根據(jù)珠江三角洲農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的 Zn2+污染程度和受污染環(huán)境中十字花科蔬菜葉和花苔中 Zn2+的含量(吳金桂等,1996),本文在斜紋夜蛾幼蟲人工飼料中添加不同濃度(0～1000 mg Zn/kg)的 Zn2+,連續(xù)三代飼養(yǎng)幼蟲,對連續(xù)三代 6齡幼蟲消化道前腸、中腸和后腸中的 Zn2+含量進(jìn)行了比較分析,其結(jié)果為進(jìn)一步了解昆蟲消化道對重金屬的積累和解毒機(jī)制提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 斜紋夜蛾幼蟲的飼養(yǎng)和 Zn的脅迫處理

斜紋夜蛾是中山大學(xué)昆蟲學(xué)研究所養(yǎng)蟲室人工飼料飼養(yǎng)(陳其津等,2000),在人工飼料中添加不同濃度的 Zn2+,并以此連續(xù) 3代飼喂斜紋夜蛾幼蟲：以第 1代幼蟲化蛹后,羽化成蟲所產(chǎn)的卵作為第 2代蟲源,第 3代以此類推。重金屬 Zn2+來源于ZnCl2(Merck,Darmstadt,Germany),將 ZnCl2添加在人工飼料中,使 Zn2+終濃度分別為 0(對照)、50、100、150、500和 1000 mg Zn2+/kg。以不添加 ZnCl2飼料飼養(yǎng)的斜紋夜蛾幼蟲為對照。所有的昆蟲均飼養(yǎng)在 27℃,相對濕度 65%,光周期 12L：12D條件下。每個(gè)處理濃度化的蛹和羽化的成蟲也在相同條件下飼養(yǎng)。

1.2 斜紋夜蛾 6齡幼蟲消化道不同部分的采集

從每個(gè)處理中挑選 30頭斜紋夜蛾 6齡幼蟲,先用去離子水清洗蟲體,蟲體自然晾干后,解剖并收集前腸、中腸和后腸,去除腸道內(nèi)含物后用去離子水反復(fù)沖洗腸道內(nèi)外,防止因食物殘?jiān)械?Zn2+對檢測結(jié)果的干擾,并再次用去離子水清洗,然后將收集的材料分別放入規(guī)格為 30 mm×50 mm的稱量瓶中。

由于第二代 1000 mg Zn2+/kg處理下的斜紋夜蛾成蟲的羽化率極低,因而本實(shí)驗(yàn)未檢測第三代此濃度處理后的斜紋夜蛾幼蟲腸道各部分的重金屬含量。

1.3 斜紋夜蛾 6齡幼蟲消化道不同部分中 Zn濃度的檢測

將同一世代內(nèi)收集的前腸、中腸和后腸置于120℃烘箱干燥 4 h后立即放入干燥器中冷卻。稱量 0.1 g干燥并混勻的樣品放入 50 mL安培瓶中,再加入 6 mL濃硝酸,置于電爐上消化。待棕色氣體消失冒白煙后移開安培瓶,自然冷卻后加入 1 mL高氯酸繼續(xù)消化。待棕色氣體消失,得到透明溶液后取下安培瓶,冷卻后用定性濾紙過濾,去離子水定容至 50 mL。以濃硝酸和高氯酸為空白對照,用等離子體原子發(fā)射光譜儀測定各個(gè)樣品中的 Zn2+,每個(gè)處理 3個(gè)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

斜紋夜蛾幼蟲不同樣品的 Zn含量按下列公式計(jì)算：

Zn2+含量 =C×50/W

(Zn含量單位為 mg Zn2+/kg)。

其中 C表示用原子吸收分光光度計(jì)測得的濃度(單位：mg/L);W表示樣品的干重(單位為 g)。

樣品中的 Zn2+含量數(shù)據(jù)經(jīng) lg(x+1)轉(zhuǎn)換后,進(jìn)行方差分析,并進(jìn)行多重比較(SAS,1989),以闡明對照與處理之間以及各個(gè)處理間差異的顯著性,并檢驗(yàn)?zāi)c道各部分第 1、2代和第 3代之間差異的顯著性。對斜紋夜蛾幼蟲前腸、中腸和后腸的 Zn2+含量與飼料中的 Zn濃度進(jìn)行多元回歸分析,以了解前腸、中腸和后腸的重金屬含量與飼料中 Zn2+濃度之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 三個(gè)世代 6齡幼蟲前、中、后腸對 Zn2+的積累作用

檢測結(jié)果表明斜紋夜蛾三個(gè)世代 6齡幼蟲前、中、后腸中Zn2+含量均隨著人工飼料中Zn2+濃度的升高而增加,相關(guān)性顯著(圖 1～3)。

當(dāng)飼料中 Zn濃度為 100、150、500和 1000 mg Zn2+/kg時(shí),第一代斜紋夜蛾幼蟲前腸中 Zn含量分別為 945.82、1345.68、2870.33和 2883 mg Zn2+/kg,分別是對照的 2.33、3.31、7.07和 7.10倍,且差異顯著(df=12,F=67.59,p＜0.01)。但取食含有50 mg Zn2+/kg Zn濃度的飼料后,前腸中的Zn含量(780.53 mg Zn2+/kg)雖高于對照,但與之差異不顯著。當(dāng)?shù)诙奔y夜蛾幼蟲取食 Zn2+濃度為50 mg Zn2+/kg的飼料后,前腸中 Zn2+含量(384.47 mg Zn/kg)與對照(299.45 mg Zn2+/kg)差異不顯著,顯著低于取食飼料中 Zn2+濃度分別為 100、150、500和 1000 mg Zn2+/kg后前腸中 Zn2+含量(df=12,F=291.80,p＜0.01),分別是后四者的 56.91%、39.33%、19.26%和 11.68%。當(dāng)斜紋夜蛾取食含有 Zn2+濃度分別為 50、100和 150 mg Zn2+/kg的人工飼料后,第三代幼蟲前腸中 Zn2+含量分別為327.47、429.10和 610.62 mg Zn2+/kg,與對照(276.70 mg Zn2+/kg)以及相互間差異不顯著,顯著低于飼料中 Zn2+濃度 500 mg Zn2+/kg時(shí)幼蟲前腸中 Zn2+含量(1756.48 mg Zn2+/kg)(df=12,F=31.29,p＜0.01)。

圖 1 連續(xù) 3個(gè)世代 6齡幼蟲前腸的 Zn2+濃度與飼料中 Zn2+含量的多項(xiàng)式回歸分析Fig.1 Relationships between Zn2+accumulations in foregut of the 6th instar larvae and Zn2+concentrations in artificial diets for 3 generations with regression analysis

第一代各處理斜紋夜蛾 6齡幼蟲中腸中 Zn2+含量均顯著高于對照,而且各處理之間差異顯著(df=12,F=762.02,p＜0.01)。當(dāng)?shù)诙奔y夜蛾幼蟲取食含 Zn2+濃度為 50 mg Zn2+/kg人工飼料后,中腸中 Zn含量為 561.93 mg Zn2+/kg,是對照的2.12倍,但顯著低于受 Zn2+濃度為 100、150、500、1000 mg Zn2+/kg脅迫后中腸中 Zn2+含量(df=12,F=172.33,p＜0.01),分別為后四者的 41.56%、22.90%、14.97%和 11.45%。當(dāng)飼料中 Zn2+濃度為 50和 100 mg Zn2+/kg,第三代幼蟲中腸中 Zn2+含量分別為 817.68和 829.2 mg Zn2+/kg,是對照的2.39和 2.43倍;兩者顯著低于取食含 Zn2+濃度分別為 150和 500 mg Zn2+/kg的人工飼料后中腸中Zn2+含量 (df=12,F=1077.42,p＜0.01)。

圖 2 連續(xù) 3個(gè)世代 6齡幼蟲中腸的 Zn2+濃度與飼料中 Zn2+含量的多項(xiàng)式回歸分析Fig.2 Relationships between Zn2+accumulations in midgut of the 6th instar larvae and Zn2+concentrations in artificial diets for 3 generations with regression analysis

第一代斜紋夜蛾 6齡幼蟲后腸中 Zn2+含量各處理均顯著高于對照,且各處理之間差異顯著(df=12,F=414.51,p＜0.01)。當(dāng)飼料中 Zn2+濃度為50 mg Zn2+/kg時(shí),第二代幼蟲后腸中 Zn含量為 1107.98 mg Zn2+/kg,與對照(883.37 mg Zn2+/kg)差異不顯著,但顯著低于飼料中 Zn2+濃度為 100、150、500和 1000 mg Zn2+/kg的后腸中 Zn2+含量(df=12,F=157.03,p＜0.01)。當(dāng)飼料中 Zn2+濃度分別為 50、100、150和500 mg Zn2+/kg時(shí),第三代斜紋夜蛾幼蟲后腸中 Zn2+含量分別為 1310.63、1589.45、1693.80和 4159.00 mg Zn2+/kg,顯著高于對照(662.6 mg Zn2+/kg)(df=12,F=274.97,p＜0.01)。

圖 3 連續(xù) 3個(gè)世代 6齡幼蟲后腸的 Zn2+濃度與飼料中 Zn2+含量的多項(xiàng)式回歸分析Fig.3 Relationships between Zn2+accumulations in hindgut of the 6th instar larvae and Zn2+concentrations in artificial diets for 3 generations with regression analysis

2.2 三個(gè)世代 6齡幼蟲前、中、后腸中對 Zn2+積累作用比較

斜紋夜蛾幼蟲連續(xù)三代取食含不同濃度的Zn2+飼料后,前、中、后腸中 Zn2+含量均隨著世代的增加而顯著遞減,且受各個(gè) Zn2+濃度處理后腸道各部分中 Zn2+含量世代間差異顯著(圖 4～6)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下：前腸中 Zn2+含量除對照以外,各個(gè) Zn2+處理濃度下的 Zn2+含量世代間差異顯著(50 mg Zn2+/kg：F=52.33,p＜0.01;100 mg Zn2+/kg：F=163.38,p＜0.01;150 mg Zn2+/kg：F=308.48,p＜0.01;500 mg Zn2+/kg：F=22.92,p＜0.01;1000 mg Zn2+/kg：F=27.92,p＜0.01)(圖 4)。

圖 4 Zn2+脅迫下斜紋夜蛾 3個(gè)世代幼蟲前腸中 Zn2+含量比較Fig.4 Comparison of Zn2+content in the foregut of three generations S.litura larvae feeding the artificial diet treated with different concentrations of Zn2+.

當(dāng)飼料中的 Zn2+濃度分別為 50、100、150和500 mg Zn2+/kg時(shí),中腸中 Zn2+含量世代間差異顯著(50 mg Zn2+/kg：F=24.84,p＜0.01;100 mg Zn2+/kg：F=70.16,p＜0.01;150 mg Zn2+/kg：F=133.27,p＜0.01;500 mg Zn2+/kg：F=46.13,p＜0.01)。當(dāng)飼料中的 Zn2+濃度分別為 0和1000 mg Zn2+/kg時(shí),中腸中 Zn2+含量世代間差異不顯著(0 mg Zn2+/kg：F=1.36,p＞0.05;1000 mg Zn2+/kg：F=0.96,p＞0.05)(圖 5)。

圖 5 Zn2+脅迫下斜紋夜蛾 3個(gè)世代幼蟲中腸中 Zn2+含量比較Fig.5 Comparison of Zn2+content in the midgut of three generations S.litura larvae feeding the artificial diet treated with different concentrations of Zn2+.

當(dāng)飼料中的 Zn2+濃度分別為 50、100、150和500 mg Zn2+/kg時(shí),后腸中 Zn2+含量世代間差異顯著(50 mg Zn2+/kg：F=24.84,p＜0.01;100 mg Zn2+/kg：F=70.16,p＜0.01;150 mg Zn2+/kg：F=133.27,p＜0.01;500 mg Zn2+/kg：F=46.13,p＜0.01)。當(dāng)飼料中的 Zn2+濃度分別為 0和 1000 mg Zn2+/kg時(shí),后腸中Zn2+含量世代間差異不顯著(0 mg Zn2+/kg：F=1.36,p＞0.05;1000 mg Zn2+/kg：F=0.96,p＞0.05)(圖 6)。

圖 6 Zn2+脅迫下斜紋夜蛾 3個(gè)世代幼蟲后腸中 Zn2+含量比較Fig.6 Comparison of Zn2+content in the hindgut of three generations S.litura larvae feeding the artificial diet treated with different concentrations of Zn2+.

2.3 同一世代 6齡幼蟲消化道不同部位對的 Zn2+積累作用比較

三代斜紋夜蛾幼蟲取食含不同 Zn2+濃度的人工飼料后,6齡幼蟲前腸、中腸和后腸中的 Zn2+含量均隨著飼料中 Zn2+濃度的升高而增加(圖 7～9)。

第一、二、三代斜紋夜蛾幼蟲取食含不同濃度Zn2+的飼料后,一部分 Zn2+通過消化道的吸收進(jìn)入體內(nèi),消化道各段吸收 Zn2+的能力具有差異,Zn2+在消化道各段中分布情況為：前腸 ＜中腸 ＜后腸,三個(gè)部位對 Zn2+的積累作用差異顯著。第一代各Zn2+處理濃度下前中后腸中 Zn2+含量之間的差異(0 mg Zn2+/kg：F=3.34,p＞0.05;50 mg Zn2+/kg：F=43.68,p＜0.01;100 mg Zn2+/kg：F=156.25,p＜0.01;150 mg Zn2+/kg：F=149.06,p＜0.01;500 mg Zn2+/kg：F=94.40,p＜0.01;1000 mg Zn2+/kg：F=611.04,p＜0.01);第二代各Zn2+處理濃度下前、中、后腸中 Zn2+含量之間的差異 (0 mg Zn2+/kg：F=9.23,p＞0.01;50 mg Zn2+/kg：F=140.22,p＜0.01;100 mg Zn2+/kg：F=301.50,p＜0.01;150 mg Zn2+/kg：F=976.95,p＜0.01;500 mg Zn2+/kg：F=85.45,p＜0.01;1000 mg Zn2+/kg：F=63.57,p＜0.01);第三代各 Zn2+處理濃度下前、中、后腸中 Zn2+含量之間的差異(0 mg Zn2+/kg：F=19.76,p＜0.01;50 mg Zn2+/kg：F=427.22,p＜0.01;100 mg Zn2+/kg：F=105.14,p＜0.01;150 mg Zn2+/kg：F=691.81,p＜0.01;500 mg Zn2+/kg：F=56.30,p＜0.01)。

圖 7 Zn2+脅迫下第一代斜紋夜蛾幼蟲消化道中Zn2+含量比較Fig.7 Comparision of Zn2+content in enteron of the 1st generation S.litura larvae feeding on the artificial diet treated with different concentrations of Zn2+.

圖 8 Zn2+脅迫下第二代斜紋夜蛾幼蟲消化道中Zn2+含量比較Fig.8 Comparison of Zn2+content in enteron of the 2nd generation S.litura larvae feeding on the artificial diet treated with different concentrations of Zn2+.

圖 9 Zn2+脅迫下第三代斜紋夜蛾幼蟲消化道中Zn2+含量比較Fig.9 Comparison of Zn2+content in enteron of the 3rd generation S.litura larvae feeding on the artificial diet treated with different concentrations of Zn2+.

3 結(jié)論與討論

斜紋夜蛾連續(xù) 3個(gè)世代幼蟲取食含有不同濃度 Zn2+的飼料后,過量的 Zn2+能在斜紋夜蛾每個(gè)世代 6齡幼蟲腸道中積累,積累量與食物中的 Zn2+濃度顯著相關(guān);前腸、中腸和后腸三個(gè)部位對 Zn2+的積累作用依次顯著增加。這與土壤、水生和一些植食性昆蟲相應(yīng)部位對環(huán)境中重金屬的積累作用相似(孫虹霞等,2007a,2007b;夏嬙等,2005,2008)。

消化道不同部位對 Zn2+的積累作用不同,表現(xiàn)為前腸 ＜中腸 ＜后腸,且不同部位中 Zn2+的含量均隨著 Zn2+脅迫世代數(shù)的增加而降低。當(dāng)昆蟲取食食物后,前腸將食物磨碎并在酶的作用下將食物降解,前腸的主要功能是暫時(shí)貯存食物和初步消化食物,對重金屬離子的積累能力較弱。對重金屬離子的積累作用較弱是正常的。中腸是昆蟲負(fù)責(zé)營養(yǎng)吸收的場所,消化液中過量的重金屬離子在吸收營養(yǎng)的過程中進(jìn)入中腸細(xì)胞,其積累量應(yīng)該大于前腸部位,具有很強(qiáng)的積累能力(Posthuma et al.,1993;Gerhardt et al.,2005);相似報(bào)道見諸于螞蟻,體內(nèi)的 Zn2+主要儲存在中腸中(包括馬氏管),濃度可達(dá)到 5000 ppm(Schofied et al.,1990)。后腸是排泄消化殘?jiān)墓艿?食物中的營養(yǎng)和水分被中腸吸收后 Zn2+濃度增加,高濃度的 Zn2+通過表面滲透、吸收等方式大量進(jìn)入到后腸的細(xì)胞中,這應(yīng)該是后腸中 Zn2+濃度最高的主要原因。這與 Esenin等(2000)所報(bào)道的研究結(jié)果相反,皮花天牛 Rhagium inquisitor L中腸中 Zn2+濃度顯著高于脂肪體,中腸對 Zn2+的積累作用顯著高于后腸。

斜紋夜蛾幼蟲中腸、表皮、脂肪體和血淋巴中的 Zn含量隨著脅迫世代的增加而積累(夏嬙等,2005;2008)。斜紋夜蛾幼蟲連續(xù) 3個(gè)世代受鎳 Ni脅迫后,體內(nèi)不同組織,尤其是中腸中的重金屬 Ni含量隨著世代增加而上升(孫虹霞等,2007a,2007b,2008)。在長期脅迫下,黃粉甲 Tenebrio molitor L體內(nèi)的 Cd2+雖在變態(tài)后有所下降,但其體內(nèi)的 Cd2+含量與食物中的量存在顯著相關(guān)性并隨脅迫時(shí)間的延長而增加(Linqvist and Block,1995)。而本文發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾幼蟲前腸、中腸和后腸中的Zn2+含量隨著脅迫世代的增加逐漸降低。這可能是因?yàn)椴煌M織對 Zn脅迫產(chǎn)生的不同適應(yīng)反應(yīng),斜紋夜蛾幼蟲通過自身調(diào)節(jié)以減輕重金屬 Zn2+的毒害作用。

斜紋夜蛾幼蟲連續(xù) 3個(gè)世代取食含不同濃度Zn2+的飼料后,3個(gè)世代 6齡幼蟲的前、中和后腸都對 Zn2+具有積累作用,但不同部位和不同世代的積累作用有所差異。過量的 Zn對消化道不同部位細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響,尤其對積累量最多的后腸細(xì)胞的影響有待進(jìn)一步的研究。同時(shí),斜紋夜蛾幼蟲前腸、中腸和后腸中的 Zn2+含量隨著脅迫世代的增加逐漸降低,這是否與昆蟲抗性有關(guān)也有待于進(jìn)一步探討。

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