用RT-PCR方法檢測豬瘟細(xì)胞苗中污染牛病毒性腹瀉病毒

范學(xué)政,寧宜寶,王 琴,徐 璐,沈青春

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家豬瘟參考實驗室,北京海淀100081)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)與豬瘟病毒(CSFV)均屬黃病毒科(F laviviridae)、瘟病毒屬(Pestivirus)成員。近幾年牛感染BVDV而持續(xù)帶毒現(xiàn)象時有發(fā)生。豬瘟細(xì)胞苗在生產(chǎn)過程中要用牛血清、胰酶、牛睪丸等材料,這些材料中若帶有低滴度的BVDV病原,會造成豬瘟細(xì)胞苗的污染。另外,用含BVDV抗體的牛血清也會干擾豬瘟病毒的體外培養(yǎng)[1]。更為嚴(yán)重的是,豬使用污染的豬瘟疫苗后可感染BVDV,出現(xiàn)類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化[2]。王新平等也從我國疑似豬瘟病料中檢出了 BVDV[3]。但BVDV株與CSFV株的核苷酸同源性約60%,氨基酸同源性約85%[4],在血清學(xué)上存在交叉反應(yīng)[5],因而血清學(xué)方法難以區(qū)分,用常規(guī)的病原檢測方法難以對BVDV和CSFV進(jìn)行鑒別檢測和診斷。目前,我國豬瘟活疫苗中BVDV污染情況時有發(fā)生,對疫苗質(zhì)量帶來很大危害,為了調(diào)查BVDV在我國豬瘟活疫苗中的污染情況,建立特異敏感的 RTPCR方法對豬瘟細(xì)胞活疫苗進(jìn)行檢測,保障豬瘟細(xì)胞活疫苗的質(zhì)量勢在必行。

1 材料與方法

1.1 試驗用材料 BVDV O regon C24V株(cvcc AV 69,F5)、BVDV NADL 株(cvcc AV 67)及豬瘟兔化弱毒株(cvcc AV 1412)、BT細(xì)胞由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種室提供,健康牛睪丸細(xì)胞為乾元浩北京生物制品廠張萬林博士惠贈;待檢豬瘟細(xì)胞苗為2008年從10個生物制品廠家抽檢的樣品,共計23個批次。

1.2 BVDV RT-PCR方法的建立

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參考GenBank中BVDV O regon C24V(AF091605)和 HCLV(AF531433)序列,設(shè)計了一對能夠鑒別BVDV與HCLV的引物,擴(kuò)增長度為470 bp,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,用水稀釋至50 pm ol/μL。

1.2.2 RNA提取及合成cDNA 用T rizol裂解法提取BVDV Oregon C24V株RNA,按說明書進(jìn)行,RNA模板用12μLDEPC水稀釋,然后按SSTⅢ反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系的建立 對PCR反應(yīng)的退火溫度、引物濃度及dNTP濃度等進(jìn)行初步優(yōu)化后確定反應(yīng)體系。

1.2.4 RT-PCR特異性試驗 對BVDV Oregon C24V株、NADL株、Oregon C24V與 HCLV株混合樣品、HCLV株、牛睪丸細(xì)胞培養(yǎng)物等進(jìn)行RTPCR并凝膠電泳,對470 bp大小的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定。

1.3 豬瘟細(xì)胞苗中BVDV的檢測 用無菌水按1 mL/20頭份量將23個批次的疫苗分別稀釋,12 000 r/min離心30 min,取上清提取RNA,cDNA的合成和PCR過程按1.2進(jìn)行,凝膠電泳檢測,對陽性樣本進(jìn)行序列測定。

1.4 豬瘟細(xì)胞苗中 BVDV的序列比對 用DNAStar軟件包對序列進(jìn)行比對,分析BVDV毒株的基因型。

1.5 豬瘟細(xì)胞苗中污染BVDV在BT細(xì)胞中的增殖 將檢測出BVDV污染的疫苗批次接種BT細(xì)胞,用含 5%FBS的 MEM 培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下維持培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長情況。

2 結(jié)果

2.1 BVDV RT-PCR檢測方法的建立

2.1.1 RT-PCR反應(yīng)條件 通過條件初步優(yōu)化,確定反應(yīng)體系為：上、下游引物工作濃度均為 0.6 pmol/μL,dNTP(each)濃度為 200 μmol;反應(yīng)程序為：94℃3 min,94℃40 s,59℃40 s,72℃35 s,40個循環(huán),72℃延伸10m in。

2.1.2 RT-PCR特異性試驗 用本文建立的RTPCR方法能檢測出Oregon C24V株和NADL株,擴(kuò)增出470 bp大小的條帶,與理論值相符;而 HCLV株和牛睪丸細(xì)胞對照沒有擴(kuò)增出條帶(圖1),將PCR產(chǎn)物測序后,與Oregon C24V株(AF091605)和NADL株(M 31182)進(jìn)行比對,證明為BVDV Oregon C24V株和NADL株的特異序列。

圖1 不同樣本的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 豬瘟細(xì)胞苗中污染BVDV的檢測 用建立的方法將23個批次的豬瘟細(xì)胞苗進(jìn)行BVDV檢測,電泳后發(fā)現(xiàn)1、11、12、23、24號疫苗有陽性擴(kuò)增(圖略)。BVDV污染率為5/23=21.74%。

2.3 豬瘟細(xì)胞苗中污染BVDV在BT細(xì)胞中的增殖 將BVDV陽性疫苗稀釋后離心取上清接種BT細(xì)胞,在培養(yǎng)5 d后細(xì)胞體積增大,邊緣不整齊,胞漿中出現(xiàn)典型小空泡CPE,呈葡萄狀排列。而健康細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,邊緣整齊(圖2)。

2.4 豬瘟細(xì)胞苗中污染BVDV的序列比對 用DNAStar進(jìn)行序列分析,證實污染的BVDV毒株全部為 BVDV I型,與 BVDV O regon C24V株(AF091605)的核苷酸相似性為83.2%～83.5%,與NADL株(M 31182)的核苷酸相似性為86.4%～86.7%(圖3)。

3 討論與小結(jié)

在我國控制豬瘟采取的是強(qiáng)制免疫措施,但豬場中經(jīng)常發(fā)生一些不明原因的豬瘟免疫失敗現(xiàn)象,除了免疫程序、母源抗體干擾、豬瘟病毒持續(xù)感染等因素外,還可能與豬瘟疫苗污染BVDV而導(dǎo)致BVDV感染有關(guān)。Carbrey E A等觀察到母豬感染BVDV的癥狀為屢配不孕、產(chǎn)仔數(shù)下降和流產(chǎn)[6],經(jīng)胎盤感染的仔豬可在出生后產(chǎn)生BVDV抗體,也有可能形成持續(xù)性感染,并且可將BVDV傳播給易感的母豬。但也有報道豬感染BVDV后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)能抵抗CSFV的傳播[7]。

目前豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)中對BVDV病原的檢測方法主要有細(xì)胞培養(yǎng)、CSFV/BVDV/PPV三價熒光染色及其抑制試驗等,但這些方法在實際工作很難將CSFV和BVDV進(jìn)行區(qū)分,不利于生物制品原材料的快速檢測。豬瘟原代細(xì)胞苗在生產(chǎn)過程中要用到牛血清、牛睪丸等牛源產(chǎn)品,原材料中若帶有低滴度的BVDV,就極易造成豬瘟細(xì)胞苗污染,荷蘭Wensvoort G等報道由于疫苗污染引起了8起豬的BVDV感染[1]。近幾年來豬瘟細(xì)胞苗質(zhì)量不穩(wěn)定,如滴度偏低,收次減少等,是否與細(xì)胞帶有低滴度的BVDV有關(guān)?為解決這些問題,有必要用更加敏感快速的方法來檢測BVDV。同時,使用傳代細(xì)胞替代原代細(xì)胞,用物理方法除去血清中污染的外源病原,可有效解決活疫苗中病原污染問題。寧宜寶等在這方面的研究已取得較大進(jìn)展。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和廣東永順聯(lián)合研制的豬瘟疫苗傳代細(xì)胞生產(chǎn)工藝已獲準(zhǔn)田間試驗。

PCR方法作為一種分子診斷技術(shù),具有常規(guī)診斷方法不可比擬的優(yōu)點。近年來國內(nèi)外也建立了一些檢測BVDV的PCR和核酸探針方法,對于牛源BVDV的診斷有良好的效果。但對于豬源BVDV和CSFV的鑒別診斷仍然不足。本研究通過對GenBank中BVDV毒株序列和CSFV毒株序列的綜合考慮,建立了一種特異性強(qiáng)、能夠區(qū)分HCLV和基因I型BVDV的PCR方法。通過對23批豬瘟細(xì)胞苗進(jìn)行PCR檢測,發(fā)現(xiàn)有5批污染BVDV,污染率為21.74%。且全部為BVDV I型,與BVDV Oregon C24V株(AF091605)的核苷酸相似性為83.2%～83.5%,與NADL株(M 31182)的核苷酸相似性為86.4%～86.7%。這種污染是否會導(dǎo)致豬瘟疫苗免疫失敗、豬體感染及持續(xù)帶毒?值得行業(yè)者共同關(guān)注。

本研究中引物設(shè)計是針對BVDV-I型的,豬瘟疫苗中是否有BVDV-Ⅱ型污染尚不清楚。需用多種方法進(jìn)行檢測才能全面了解豬瘟活疫苗的具體污染情況。通過本研究建立的PCR方法能區(qū)分BVDV和HCLV,可用于豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)中的質(zhì)控,以及豬群感染BVDV-I型情況的調(diào)查。

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