奶牛隱性乳房炎診斷方法比較

高玉君 ，牛家華 ，梁海濱 ，張廣慶 ，王玉才

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100094；2.泰安市畜牧獸醫(yī)局，山東泰安 271000；3.岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山東泰安；4.新泰市羊流鎮(zhèn)獸醫(yī)站，山東新泰 271000）

奶牛乳腺炎是世界乳制品行業(yè)危害性很大的疾病，據(jù)報道，乳腺炎給奶牛業(yè)造成的危害包括：直接造成產(chǎn)奶量減少；由于牛奶變質(zhì)和藥物殘留使其不能被食用；一些牛無法治愈被淘汰造成的損失；在治療乳腺炎期間醫(yī)療費的開支；護理病牛所需的勞動力開支等[1]。世界上多數(shù)國家奶牛乳腺炎的發(fā)病率約為40%，每頭牛產(chǎn)奶量平均減少約15%。在美國自20世紀90年代以來受此影響，每年經(jīng)濟損失達20億美元，平均每頭牛每年損失200美元左右[2-3]。我國每年因乳房炎損失也超過了3億元。更為嚴重的是由于某些乳腺炎具有傳染性，少數(shù)幾頭牛的感染就?？蓪?dǎo)致整個牛場乳腺炎的蔓延。

臨床型乳房炎可產(chǎn)生明顯的癥狀，如泌乳量下降，乳房腫脹，乳房的炎癥變化等臨床癥狀較易作出診斷。奶牛隱性乳房炎的診斷方法有多種：乳汁體細胞計數(shù)，CMT法，乳盤實驗，NaGase法，氯化鈣凝乳試驗及改良法，乳房炎簡易診斷液法，乳中細菌ATP含量測定法，蘭州LMT隱乳試驗，牛乳酶學(xué)試驗，乳中乳酸脫氫酶、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶、血清白蛋白含量測定，微生物學(xué)培養(yǎng)，SMT試劑診斷法，免疫學(xué)診斷等[4-8]。

本次試驗通過對76頭奶牛進行隱性乳房炎調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)37頭患有隱性乳房炎，對其中17頭奶牛68個乳區(qū)分別采用細菌學(xué)檢測、CMT（California mastitis test）、BTB（Bromo—thymol blue test）、NFT（Negretti field test）、氯化物硝酸銀試驗等體細胞計數(shù)（Somatic cell count，SCC）方法對其進行比較性診斷，并作出評價，以探討在泰安尋找一種比較準確可靠、經(jīng)濟實用的乳房炎診斷方法。

1 材料

1.1 被檢奶牛

17頭黑白花奶牛處于不同的泌乳期（4，3，2胎），平均年齡為 5.2周歲。衛(wèi)生管理、營養(yǎng)狀況一般，場內(nèi)乳房炎、陰道炎、胎衣不下、子宮內(nèi)膜炎較高，場內(nèi)結(jié)核、副結(jié)核檢疫陰性，對17頭奶牛按照牛耳標號從小到大排列編成1~17號。

1.2 奶樣的采集

采樣前首先用清潔的濕毛巾擦凈乳頭，然后用千分之一的新潔爾滅消毒乳頭。采樣時先擠掉3~4把奶，再將20 mL乳樣擠入已經(jīng)高壓滅菌的試管中，在試管上詳細標記奶牛耳標號和乳區(qū)，送至實驗室檢驗，時間間隔不超過24小時。

1.3 材料 尹紅—美蘭培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂、營養(yǎng)肉湯、微量發(fā)酵管、綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基（將馬鈴薯去皮切成小塊，取 200 g，玉米粒大小，1 000 mL水煮沸30 min，用雙層紗布過濾得汁，加水補足1 000 min，加瓊脂粉25 g，葡萄糖2 g，用80%的乳酸調(diào)pH值到6.0~8.0，經(jīng)高壓滅菌，冷卻后，傾注平皿，冷藏保存）。

BTB試劑、NFT試劑、BMT診斷液、CMT試劑等。

2 方法

2.1 先進行細菌的分離和鑒定，取17頭奶牛的乳樣68個乳區(qū)乳樣68份，每份 10 mL，2 000~3 000 r/min離心15 min，棄去管中的上層液體，留取底部沉淀物，無菌操作吸取0.1 mL乳樣分別接種于綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、尹紅—美蘭培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基[9-10]。

2.2 然后用各檢測法進行對比

2.2.1 CMT試驗 用于間接檢測乳汁中體細胞總數(shù)。將等量的試劑與乳汁混合，10 s后根據(jù)判斷標準觀察結(jié)果。

2.2.2 NFT試驗 用于間接檢測乳汁中體細胞總數(shù)。將乳汁和試劑按比例混合，10 s后根據(jù)判定標準觀察結(jié)果。

2.2.3 體細胞計數(shù)用于直接檢測乳汁中體細胞數(shù)。將0.01 mL乳汁在載玻片中央涂布約1 cm，經(jīng)干燥、脫脂、固定、染色、脫色后，干燥鏡檢。根據(jù)公式計算結(jié)果。以每毫升乳汁含有50萬個細胞以上為隱性乳房炎陽性。

2.2.4 BTB試驗用于間接檢測乳汁中pH。將第一部分乳汁充分搖勻，吸取被檢乳汁5 mL置潔凈試管，再加1mLBTB試劑，搖勻靜置10s后觀察顏色反應(yīng)，根據(jù)判斷標準觀察結(jié)果。

2.2.5 氯化物硝酸銀試驗 用于檢測乳汁中氯化物的含量。試劑和乳汁按比例混合后，呈棕紅色者為陰性乳；呈黃色者為陽性乳。

3 結(jié)果

3.1 細菌檢測（見表1） 在68個乳區(qū)中的32個乳區(qū)共檢測到43株細菌。其中鏈球菌9.30%（4/43）、大腸桿菌 30.23%（13/43）、葡萄球菌 30.23%（13/43）、棒狀桿菌 11.63%（5/43）、沙門氏菌 4.65%（2/43）、枸櫞酸桿菌4.65%（2/43）、酵母菌 9.30%（4/43）。

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3.2 體細胞計數(shù)檢測結(jié)果（見表2）用體細胞計數(shù)對68個乳區(qū)的乳樣進行檢測，乳房炎陽性乳區(qū)28個，陽性率為 41.18%（28/68），陰性乳區(qū) 40個，陰性率為 58.82%（40/68）。

3.3 CMT檢測結(jié)果（見表2） 用CMT試劑對68個乳區(qū)的乳樣進行檢測，乳房炎陽性乳區(qū)28個（其中強陽性6個、陽性15個、弱陽性7個），陽性率為41.18%（28/68）；可疑乳區(qū)1個，可疑率1.47% ；陰性乳區(qū)39個，陰性率為57.35%（39/68）。

3.4 BTB檢測結(jié)果（見表2） 用BTB試劑對68個乳區(qū)的乳樣進行檢測，乳房炎陽性乳區(qū)23個，陽性率為33.82%（23/68），可疑乳區(qū) 20個，可疑率為 29.41%（20/68）；陰性乳區(qū) 25個，陰性率為 36.76%（25/68）。

3.5 NFT檢測結(jié)果（見表2） 用NFT試劑對68個乳區(qū)的乳樣進行檢測，乳房炎陽性乳區(qū)24個，陽性率為35.29%（24/68），可疑乳區(qū) 18個，可疑率為 26.47%（18/68），陰性乳區(qū) 26個，陰性率為 38.24%（26/68）。

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3.6 氯化物硝酸銀試驗結(jié)果（見表2） 用氯化物硝酸銀試劑對68個乳區(qū)的乳樣進行檢測，隱性乳房炎陽性乳區(qū)22個，陽性率為29.41%（20/68），可疑乳區(qū)25個，可疑率為36.76%（25/68）；陰性乳區(qū) 21個，陰性率為 30.88%（21/68）。

結(jié)果表明：體細胞計數(shù)、CMT、BTB、NFT、氯化物硝酸銀的乳區(qū)陽性符合率分別為100.00%、100.00%、82.14%、85.71%、78.57%。

4 討論

4.1 對泰安市奶牛場牛群中17頭患有隱性乳房炎臨床癥狀的奶牛進行檢測，結(jié)果在32個乳區(qū)檢測到43株病原菌；對68個乳區(qū)的乳汁用各種診斷方法檢測，對不同方法的檢測結(jié)果進行比較發(fā)現(xiàn)體細胞計數(shù)法、CMT和細菌學(xué)檢查據(jù)有高度的一致性，監(jiān)測到28個乳區(qū)存有隱性乳房炎。

4.2 CMT試驗是美國加利福尼亞州乳腺試驗，其基本原理是陰離子表面活性劑一烷基或烴基硫酸鹽，破壞乳中的體細胞，釋放其中的核酸，核酸與試劑結(jié)合產(chǎn)生沉淀或凝膠。細胞中聚合的脫氧核糖核酸（DNA）是CMT產(chǎn)生反應(yīng)的主要成分，乳中體細胞越多，釋放的DNA越多，產(chǎn)生的沉淀或凝膠也就越多。國內(nèi)許多研究機構(gòu)根據(jù)相似原理研制出各種隱性乳房炎檢測試劑，如 LMT、BMT、HMT等，達到了CMT的國產(chǎn)化。根據(jù)試驗結(jié)果，CMT對奶牛隱性乳房炎檢測效果較好，具有操作簡便、敏感可靠、價廉等特點，特別適用于大型奶牛場的現(xiàn)場快速診斷。

4.3 體細胞計數(shù)是指每毫升乳汁中含有的體細胞數(shù)量。體細胞包括多種類型的細胞：中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、酸性粒細胞及各種乳腺上皮細胞。乳汁體細胞計數(shù)是一種可靠、傳統(tǒng)監(jiān)測奶牛隱性乳房炎的方法，可確定乳汁中體細胞數(shù)范圍，較精確的判斷隱性乳房炎的炎癥程度，對乳房炎的診斷具有重要意義。但步驟較繁瑣，耗時較長，只適用于實驗室診斷，在臨床檢測中受到限制。

4.4 BTB、NFT和氯化物硝酸銀試驗雖然較為方便，但由于檢出率低，特別對泌乳末期的奶牛檢測可出現(xiàn)假陽性，因而各檢測方法不宜單獨使用。此外，BTB和氯化物硝酸銀試驗中對顏色的判斷可出現(xiàn)較大的誤差，易誤判。

4.5 本次試驗病原菌的檢出率與乳房炎檢出陽性率具有較高的符合率，達100%。但在正常乳汁中也檢測到了細菌的存在，可見細菌的分離鑒定并不是一種很好的診斷方法。因此，對奶牛場乳房炎進行細菌學(xué)調(diào)查有助于了解菌群的分布，對更好的防治奶牛乳房炎，進一步提高牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義，對于臨床診斷意義較小。

4.6 目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)在檢測致病菌方面得以廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外多有報道利用PCR技術(shù)檢測奶牛乳房炎，快速鑒定病原菌，但一般奶牛場很難有力量購買此類儀器。也有養(yǎng)殖場使用有計步器來監(jiān)測奶牛乳房炎等疾病發(fā)生情況，泰安魯寶養(yǎng)殖有限公司采用以色列的先進養(yǎng)殖技術(shù)、牧場管理系統(tǒng)、擠奶設(shè)備、TMR奶牛全價日糧攪拌車、牛只自動稱重設(shè)備和牛只計步器，來詳細統(tǒng)計每頭奶牛每天的活動量和采食量等情況，再通過乳汁、飼料、飲水等指標，通過數(shù)據(jù)分析、對比，測定每頭奶牛是否患有乳房炎、踢葉炎、發(fā)情等情況，該方法測算準確，對大型奶牛場管理很有幫助。但投資大，一般奶牛場很難達到。

綜上所述，我們認為CMT和體細胞計數(shù)是檢測隱性乳房炎較好方法，其中CMT最簡單快捷、經(jīng)濟實用，BTB、NFT、氯化物硝酸銀和細菌學(xué)檢測可輔助其他方法進行診斷。有條件的奶牛場可使用PCR技術(shù)或計步器等技術(shù)[11-12]。

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