強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)胞內(nèi)聚合物測定方法優(yōu)化

由 陽，彭永臻，，王淑瑩，劉秀紅

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 市政環(huán)境工程學(xué)院，哈爾濱150090，youyang1979@sina.com.cn;2.北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，北京100124)

多聚脂肪酸(PHA)、糖原和多聚磷酸鹽(poly-P)是強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)(EBPR)中聚磷菌(PAO)體內(nèi)的主要能量和物質(zhì)貯存方式，聚磷菌在厭氧條件下吸收廢水中的碳源，貯存PHA，分解體內(nèi)的多聚磷酸鹽，把正磷酸鹽釋放到水體中，釋放能量，分解糖原.在好氧狀態(tài)下，聚磷菌分解PHA 并釋放出能量，用以細(xì)胞合成和糖原積累，大量吸收水體中的正磷酸鹽，在體內(nèi)貯存多聚磷酸鹽顆粒［1］.可見，多聚磷酸鹽是PAO 體內(nèi)磷以及能量的貯存物質(zhì);PHA 為細(xì)胞生長和糖原合成提供前體;糖原水解的過程中為脂肪酸轉(zhuǎn)化成PHA 提供還原力.因此，PHA、多聚磷酸鹽以及糖原的貯存能力是直接影響系統(tǒng)除磷性能的關(guān)鍵因素.準(zhǔn)確定量這3 種物質(zhì)對研究和評價強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)非常重要.

PHA 的測定分為提取和測定兩步［2-3］.測定有分光光度法和氣相色譜法兩種，其中分光光度法的靈敏度比氣相色譜法要低很多.糖原的定量方法包括把聚合物水解成葡萄糖和測定葡萄糖量兩個步驟［4］.定量葡萄糖有高效液相色譜和化學(xué)分析兩種方法，其中高效液相色譜靈敏度高.正磷酸鹽的測定一般采用國標(biāo)方法.本研究將色譜法和化學(xué)分析手段相結(jié)合，對強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)內(nèi)的這3 種多聚物的測定方法進(jìn)行了優(yōu)化，試圖找到準(zhǔn)確快捷、在實(shí)驗(yàn)室簡單易行的測定方法.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 PHA 的測定

PHA 是在細(xì)胞質(zhì)中被一層膜物質(zhì)包圍的大約0.2 到0.5 μm 的顆粒［5］.在聚磷菌體內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)貯存的PHA 是一種典型的共聚物，這種共聚物主要由3-羥基丁酸(3HB)和3-羥基戊酸(3HV)單體組成，還有一少部分的3-羥基，2 烷基丁酸(3H2MB)和3-羥基，2-甲基戊酸(3H2MV).

本研究中PHA 測定采用的方法［6-7］為:從EBPR 反應(yīng)器中取得活性污泥后，按1%(體積分?jǐn)?shù))的比例與甲醛混合以抑制污泥中微生物的活動.混合液經(jīng)離心后上清液去除，然后以磷酸鹽混合液清洗樣品，再次離心后上清液再次去除.之后樣品在-36 ℃，0.076 mbar 下冷凍干燥(Labconco，American)脫水20 h.用天平(Mettler，Switzerland)稱取凍干污泥30 mg 和PHB、PHV 標(biāo)準(zhǔn)品一起放入有膠塞并配有螺旋扣塑料帽的玻璃管中，加入2 mL 氯仿和2 mL 酸化甲醇酯化液(酯化液為含有4%，10%，20%硫酸的甲醇).緊緊密封蓋子后放入干式恒溫器(Sanyo，Japan)中，在100 ℃下消解2，4 或20 h.冷卻到室溫后加入1 mL 的純水(Millipore，American)，混合后劇烈震蕩以去除氯仿相中的殘?jiān)?靜沉1 h 以實(shí)現(xiàn)相的分離，然后以移液器(Gilson，F(xiàn)rance)吸出下層的氯仿相放入另一個小瓶中，以硫酸鈉干燥后，3 μL上色譜分析.PHB 和PHV 的標(biāo)準(zhǔn)樣品采用美國西格瑪公司產(chǎn)品(sigma，cat NO.81329，403105)，分別準(zhǔn)確稱取0.5，1，1.5，2，2.5，3.0 mg標(biāo)準(zhǔn)樣品放入消解瓶中，其他測定步驟跟污泥樣品測定相同，上氣相色譜分析后做得標(biāo)準(zhǔn)曲線PHB 為:y =221.529 0 x -95.518 3，回歸系數(shù)為0.999 15.PHV 標(biāo)線為:y=353.560 4 x+10.403 8，回歸系數(shù)為0.999 13.

氣相色譜(hp 6890N，American)配備HP INNOVAX 色譜柱(30 m length×320 μmID×0.25 μmfilm)，進(jìn)樣口溫度200 ℃，分流比為1∶25，氮 氣 做 載 氣，F(xiàn)ID 檢 測 器 工 作 溫 度 為250 ℃，爐溫采用程序升溫，150 ℃保持1 min，然后以10 ℃/min的速度升到250 ℃并保持1 min.

1.2 糖原的測定

糖原是一種分支狀的聚合體，它由葡萄糖單體以糖苷鍵連接而成.它的定量方法包括把聚合物水解成葡萄糖和測定葡萄糖量兩個步驟.然而區(qū)別葡萄糖是糖原水解產(chǎn)生的還是其他碳?xì)浠衔锼猱a(chǎn)生的是不可能的，所以，目前大多研究都不是定量糖原，而是定量總碳水化合物.定量葡萄糖有高效液相色譜和化學(xué)分析兩種方法，其中高效液相色譜靈敏度高，但是對色譜柱的選擇和維護(hù)要求比較高，費(fèi)用很高.

本實(shí)驗(yàn)中糖原測定的前幾個步驟與PHA 測定的步驟相同，污泥樣品經(jīng)預(yù)處理，清洗，20 h 凍干后，準(zhǔn)確稱量30 mg 放入帶膠塞和螺旋塑料蓋的玻璃瓶中.然后加入5 mL 0.4，0.6 或0.8 mol/L HCl，在恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo，Japan)中100 ℃下消解1，3，5 或7 h，冷卻后以0.25 μm 的膜過濾.取樣品2 μL 以葡萄糖氧化酶法試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)測定樣品中的葡萄糖含量.

1.3 多聚磷酸鹽的測定

聚磷菌貯存在體內(nèi)的多聚磷酸鹽顆粒又叫做異染顆粒，它是由正磷酸鹽單體以酯鍵結(jié)合形成的線性或環(huán)形聚合物.多聚磷酸鹽的測定基本分為3 個步驟:1)樣品的干燥脫水.2)生物質(zhì)消解使多聚磷酸鹽顆粒轉(zhuǎn)化成正磷酸鹽.3)正磷酸鹽的測定.

本實(shí)驗(yàn)先測得反應(yīng)器上清液中正磷酸鹽質(zhì)量濃度，再使用純水清洗污泥樣品，采用凍干機(jī)干燥，準(zhǔn)確稱量0.45 mg 后放入250 mL 錐型瓶中，加入100 mL 純水和40 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))過硫酸鉀溶液［8］，蓋塞包緊后放入壓力滅菌鍋(Sanyo，Japan)后于110，120 和130 ℃中分別加熱20，30，40 min，冷卻后移至250 mL 容量瓶中定容，取出少量以鉬銻抗光度法測定正磷酸鹽質(zhì)量濃度.污泥中聚磷的含量既為消解后正磷酸鹽與消解前正磷酸鹽濃度之差.試劑空白和標(biāo)準(zhǔn)溶液系列也經(jīng)同樣的消解操作.標(biāo)準(zhǔn)曲線為y =104.59x -0.015 9，回歸系數(shù)為R2=0.999 6.

本實(shí)驗(yàn)中利用的活性污泥樣品都來自于有PAOs 富集的、以丙酸為唯一碳源的EBPR 反應(yīng)器.富含PHB 的污泥采自SBR 反應(yīng)器厭氧階段末端，富含多聚磷酸鹽顆粒和糖原的污泥取自SBR 反應(yīng)器好氧階段末端.

2 結(jié)果與討論

2.1 PHA 的測定優(yōu)化

以不同酸化甲醇體積分?jǐn)?shù)提取PHB 的提取物結(jié)果見圖1.可以看出，PHB 的提取量受酸化甲醇體積分?jǐn)?shù)影響很大，4%的酸化甲醇取得了最大回收量.這個結(jié)果與很多研究是一致的［2］，另外，10%和20%酸化甲醇的樣品在大于10 h 消解時，提取物的量都有下降趨勢，這是由于過大的酸化甲醇體積分?jǐn)?shù)引起樣品中的3HB 片段的進(jìn)一步降解，產(chǎn)生了另外一些更簡單的有機(jī)物，導(dǎo)致提取的PHB 的量減少.所以，4%的酸化甲醇體積分?jǐn)?shù)是最合適的.從圖中還可以看出，消解生物質(zhì)產(chǎn)生3HB 單體需要一定的反應(yīng)時間，在2 h 時，提取物的量很少，而當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到11 h 后，提取物的量有大幅度的提高，而4%酸化甲醇的樣品甚至在11 ～20 h 之間還有提高，這說明足夠的反應(yīng)時間是必要的.雖然Adrian［2］等人認(rèn)為2 h 的反應(yīng)時間就可以提取細(xì)胞內(nèi)的大部分PHB，但是本研究經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，只有達(dá)到充足的反應(yīng)時間才能達(dá)到最大的回收量.

圖1 不同消解時間提取PHB 的比較

以不同酸化甲醇體積分?jǐn)?shù)提取PHV 提取物的結(jié)果見圖2.

圖2 不同消解時間提取PHV 的比較

與PHB 相比，PHV 的提取受酸化甲醇體積分?jǐn)?shù)變化的影響不大，20%酸化甲醇的提取物在消解大于10 h 時，還是會有量的減少，這說明在這個體積分?jǐn)?shù)下，PHV 也會發(fā)生降解.4%和10%酸化甲醇的樣品在消解20 h 時都能達(dá)到最大回收，所以，這兩個體積分?jǐn)?shù)比較適合提取PHV.同樣，PHV 的消解反應(yīng)需要至少11 h 的時間.

為了檢測4%的酸化甲醇和消解20 h 提取PHB、PHV 方法的準(zhǔn)確度，采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行考察.取5 份凍干后的污泥樣品放入消解瓶后再加入PHB 和PHV 純品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1.

表1 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表1 可知，以4%的酸化甲醇和消解20 h 來提取PHB 和PHV，準(zhǔn)確度很好，說明這一方法的測量值接近于真值，系統(tǒng)誤差小，加標(biāo)回收率分別為98.6%～102.1%和97.1%～102.5%.

2.2 糖原的測定優(yōu)化

樣品經(jīng)預(yù)處理、凍干、消解成葡萄糖后，可以通過多種方法測定葡萄糖含量.國際上EBPR 系統(tǒng)糖原的測定多采用高效液相色譜法HPLC［9-10］.本研究初始階段試圖應(yīng)用配有C18柱(waters，American)的液相色譜(waters，American)分離葡萄糖，使用折光率檢測器，0.6 mL/min，0.004 mol/L H2SO4做流動相，但經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，C18 柱無法把葡萄糖和消解液中的其他物質(zhì)分離開，這可能是因?yàn)橄庖旱碾x子間力太強(qiáng)，阻礙了葡萄糖的分離.后期實(shí)驗(yàn)采用氧化酶法葡萄糖試劑盒［11］測定葡萄糖含量，在不同消解時間和鹽酸濃度下糖原的提取結(jié)果見圖3.

圖3 不同消解時間和鹽酸濃度下糖原的提取

從圖3 可以看出，消解時間對糖原的提取量影響很大，在相同HCl 濃度下，不同的消解時間下提取的糖原量有很大不同，以0.6 mol/L HCl為例，消解時間為1 h 回收到的糖原量為0.028 947 mg/mg，隨著消解時間不斷增加，回收到的糖原量也不斷增加，到消解5 h 時，回收量已經(jīng)達(dá)到0.105 3 mg/mg.但是繼續(xù)增加消解時間并不能進(jìn)一步增大回收量反而會由于樣品的進(jìn)一步消解導(dǎo)致葡萄糖回收量的減少.此外，消解HCl濃度對葡萄糖回收量的影響也很大，當(dāng)消解時間很短時，回收量會隨著HCl 濃度的增加而增加;當(dāng)消解時間為3 或5 h 時，回收量先增加再減少;而當(dāng)消解時間為7 h，回收量會隨著HCl 濃度的增加而減少.總體來說，以0.6 mol/L 的鹽酸消解5 h 可以達(dá)到最大的葡萄糖回收量.

為了研究此方法的精密度，還進(jìn)行了精密度實(shí)驗(yàn)，取4 個污泥樣品，分別平行測定6 次，同時附空白，結(jié)果見表2.從表2 可知，當(dāng)取樣量控制在氧化酶法要求的線性范圍內(nèi)時所得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)都比較小，說明測定值與它們的均值的差距較小，偶然誤差小，因而實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精密度較好.

2.3 多聚磷酸鹽顆粒的測定優(yōu)化

提取的聚磷酸鹽顆粒的量與不同消解時間和消解溫度的關(guān)系可見圖4，由圖可見，聚磷酸鹽顆粒的提取量受消解時間和溫度影響很大，過高的消解溫度(130 ℃)并不能顯著提高多聚磷酸鹽的提取效率，對于把磷酸鹽聚合物降解成正磷酸鹽這一反應(yīng)來說，120 ℃的反應(yīng)條件已經(jīng)足夠，而110 ℃明顯不能使反應(yīng)充分進(jìn)行.同樣，足夠的反應(yīng)時間是必要的，20 min 不能使反應(yīng)完全，反應(yīng)基本是在30 min 時達(dá)到最大回收量，40 min 是多余的，因此，120 ℃，30 min 是消解多聚磷酸鹽顆粒的最佳反應(yīng)條件.

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 不同消解時間和消解溫度下聚磷的提取

為考察凍干污泥量與其相對應(yīng)的多聚磷酸鹽質(zhì)量濃度的相關(guān)性，分別取30 ～50 mg 的10 個樣品，測得多聚磷酸鹽質(zhì)量濃度，同與其對應(yīng)的取樣量進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見表3.

整理表3 中的數(shù)據(jù)得出消解污泥量與消解液中P 含量之間存在相關(guān)性，含P 量y=0.101 x-0.042 6，相關(guān)性R2=0.994，可見消解污泥量x 與消解液中總P 量y 存在較好的相關(guān)性，本方法可行.

表3 消解污泥量與消解液中含P 量的分析結(jié)果 mg

3 結(jié) 論

1)對強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)胞內(nèi)聚合物的測定方法進(jìn)行了優(yōu)化，其中PHA 采用化學(xué)物質(zhì)提取，氣相色譜定量;多聚磷酸鹽顆粒采用過硫酸鉀氧化，抗壞血酸法測定;糖原采用稀鹽酸消解，葡萄糖試劑盒法比色測定.

2)經(jīng)過方法優(yōu)化和精密度、準(zhǔn)確度分析，4%酸化甲醇消解20 h 是提高PHA 回收量的最佳條件.糖原在0.6 mol/L HCl 條件下消解5 h 提取量最大.在120 ℃、氧化30 min 條件下多聚磷酸鹽顆粒可以最大回收.

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