重組人p53腺病毒聯(lián)合順鉑對肺腺癌A549細胞基因表達的影響

汪進良，焦順昌，胡 毅，李瑾昱

解放軍總醫(yī)院腫瘤內科，北京100853

肺癌是當前人類最常見的惡性腫瘤之一，為腫瘤死亡的首要病因。肺癌的治療除少數早期患者可手術切除外，絕大多數的晚期患者仍是以化療和放療為主，但總的5年生存率不到15%。由于60%以上的肺癌組織中存在p53基因突變，因而針對p53突變的基因治療成為了研究熱點?；A及臨床研究表明，以腺病毒為載體，與人野生型p53cDNA重組構建的重組人p53腺病毒 (recombinant human adenovirus p53，rAd-p53)可有效抑制腫瘤生長，同時，rAd-p53可與化療藥物聯(lián)合使用，增加腫瘤細胞對化療藥物敏感性［1］。另有研究表明，當rAd-p53與順鉑 (cisplatin，DDP)聯(lián)合時，可明顯增加DDP對肺腺癌A549細胞的抑制作用，其機制與細胞周期阻滯有關［2］。本研究通過基因芯片的方法，從基因水平探討rAd-p53提高DDP對肺腺癌A549細胞抑制作用的機制，以期為rAd-p53和化療的聯(lián)合應用提供依據。

材料和方法

材料人肺腺癌A549細胞由我科胡毅博士取自中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所。重組人p53腺病毒注射液 (今又生)由深圳市賽百諾基因技術有限公司提供，批號:20070501。順鉑注射液由江蘇豪森藥液股份有限公司提供，批號:070203。胰蛋白酶-EDTA消化液為美國Amresco公司產品，胎牛血清為美國Hyclone公司產品，RPMI-1640培養(yǎng)基為美國invitrogen公司產品。人腫瘤相關基因芯片由北京博奧生物公司提供。RNA Clean-up試劑盒和PCR Nucleo-Spin ExtractⅡ試劑盒為德國MACHEREY-NAGEL公司產品;dNTPs和 RQ1 RNase-Free DNase為美國 Promega公司產品;Cy5-dCTP和Cy3-dCTP購自美國 GE Healthcare集團;DL2000 marker為日本TaKaRa公司產品。所有引物均由Invitrogen公司合成。

樣品制備肺腺癌A549細胞按25×104細胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，待完全貼壁后，所有6孔細胞均給予0.1 mg/ml DDP，100 μl/孔。另外，其中3孔細胞給予LacZ空載病毒，標記為A1、A2、A3;另3孔給予感染強度為125 PFU/細胞的rAd-p53，標記為B1、B2、B3。加藥2 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)46 h后抽提細胞總RNA，具體操作步驟嚴格按Trizol試劑說明書進行。紫外吸收法測定樣品RNA濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。提取的總RNA樣品A1、A2、A3合并為對照組A，樣品B1、B2、B3合并為實驗組B。

樣品RNA熒光標記以總RNA起始，含有T7啟動子序列的T7 Oligo(dT)Primer為引物，使用CbcScript酶合成1st-strand cDNA;再用RNA酶H將雜合鏈中的RNA切成短片段，DNA多聚酶以RNA短片段為引物延伸，合成2nd-strand cDNA，并純化雙鏈cDNA;以cDNA為模板，利用T7 Enzyme Mix合成cRNA，然后用RNA Clean-up試劑盒純化;取2 μg cRNA，用CbcScriptⅡ酶，隨機引物進行反轉錄，反轉錄產物用PCR NucleoSpin ExtractⅡ試劑盒純化;以隨機引物對反轉錄產物進行KLENOW酶標記，標記產物用PCR NucleoSpin ExtractⅡ試劑盒純化，純化后抽干。

雜交、清洗、芯片掃描和數據分析標記的DNA溶于80 μl雜交液中 (3×SSC，0.2%SDS，5×Denhart's，25%甲酰胺)，于42℃雜交過夜。雜交結束后，先在42℃含0.2%SDS，2×SSC的液體中洗5 min，然后在0.2×SSC中室溫洗5 min。玻片甩干后用LuxScan 10KA雙通道激光掃描儀進行掃描。對照組樣品A以cy5用紅色表示，實驗組樣品B以cy3用綠色表示。對于某一點的信號來講，如果cy3信號較強，該點多顯綠色;如果cy5信號較強，該點多顯紅色;如果強度相似，即顯黃色。采用LuxScan 3.0圖像分析軟件對芯片圖像進行分析，以灰度值比值相差2倍以上作為差異具有統(tǒng)計學意義。采用SAM軟件對結果進行分析。

實時熒光定量PCR對基因芯片結果的驗證為驗證芯片結果，挑選2個表達上調基因TP53和TNFRSF6以及1個表達下調基因ABCC4做實時熒光定量PCR，以GAPDH作為內參。各基因的引物序列為:TP53:上游引物ACCACCATCCACTACAACTACAT，下游引物 ACAAACACGCACCTCAAAGC;TNFRSF6:上游引物 CGAAAATGTTCAATAATGTCCC，下游引物TTCTTTAGGTGGTTCCAGGTAT;ABCC4:上游引物 GCCAAACCTCTAACCGACAT，下游引物TTCAATACAGCCCAAACCAA;GAPDH:上游引物TGTTGCCATCAATGACCCCTT，下 游 引 物 CTCCACGACGTACTCAGCG。按試劑說明和儀器操作規(guī)程將樣品總RNA逆轉錄為cDNA，再進行實時PCR反應，利用儀器所配的軟件計算各張PCR芯片中的每個基因的Ct(C代表循環(huán)數、t代表域值，指熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數)值。最后，采用△△Ct方法比較相應基因的表達量變化，并與基因芯片結果進行對比。

結 果

細胞總RNA提取質量鑒定結果經紫外分光光度計檢測，DDP處理的對照組A549細胞提取的3份樣品A1、A2、A3總RNA和DDP聯(lián)合rAd-p53作用后提取的3份樣品 B1、B2、B3總 RNA的 A260/280值為1.8～1.9，A260/230值為1.5～1.9，即總RNA的純度較高，無明顯蛋白質及其他鹽分摻雜。瓊脂糖凝膠電泳檢測可見RNA電泳條帶清晰，28S與18S rRNA條帶亮度接近2:1。因此，總RNA可用于進一步實驗。

基因芯片掃描結果rAd-p53聯(lián)合DDP與單獨DDP處理的A549細胞的基因表達情況進行比較，43個基因表達差異2倍以上，其中15個基因表達顯著上調，28個基因表達顯著下調 (圖1，表1、2)。

實時熒光定量PCR驗證結果對照組A和實驗組B樣品的TP53、TNRSF6、ABCC4基因和作為內參的GAPDH基因分別進行實時PCR反應。實時熒光定量PCR時各樣品上樣量均為10μl，由于受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉錄效率誤差等的影響，每個樣品的10μl體積的cDNA含量并不完全相同，為校正此差異，使用GAPDH基因作為內參，以各基因的差異比除內參值，對各基因的差異比進行歸一化。計算得到TP53、TNRSF6、ABCC4基因歸一化后的差異比分別為13.26、2.20和0.64，基因芯片各基因的差異比分別為6.89、2.35和0.66。兩個結果完全一致，TP53和TNRSF6基因表達上調而ABCC4基因表達下調。

討 論

p53基因是重要的腫瘤抑制基因，編碼的P53蛋白在細胞周期調控、DNA修復和誘導細胞凋亡等方面均具有關鍵性作用，因而被譽為“基因組保護神”。許多研究表明，P53能夠影響多種細胞內信號傳導通路，從而誘導細胞凋亡、抑制生長、激活或抑制某些信號通路和抑制血管新生等［3］。既往研究證實rAd-p53聯(lián)合DDP顯著提高對腫瘤細胞的抑制率［2］，本研究采用功能分類基因芯片的方法進一步明確該作用的機制，本研究選用的人腫瘤相關基因芯片為寡核苷酸芯片，包含2 747個腫瘤相關基因的4 854個轉錄本，芯片上以4個人的看家基因GAPDH、ACTB、LDHA、RPS9作為陽性對照，點樣溶液作為陰性對照。除了在芯片設計中采取質控措施外，還采用實時PCR的方法驗證了基因芯片數據的可靠性。

本研究將rAd-p53聯(lián)合DDP與單獨DDP處理的A549細胞的基因表達情況進行比較，結果顯示43個基因的表達差異具有統(tǒng)計學意義，包括CDKN1A(即p21)、 CCND1、 FAS、 TNFSF14、 BAK1、 TP53I3、MAD2L1、BTG2、EMP1、EDNRB、MDM2基因等。這些基因的功能涉及到細胞周期、細胞凋亡以及細胞增殖等細胞生命活動的各個方面。

表1 表達上調基因Table 1 Up-regulation genes

表2 表達下調基因Table 2 Down-regulation genes

rAd-p53干預后CDKN1A即p21基因表達上調。p21基因是p53的下游基因之一，一方面p21與細胞周期蛋白E/CDK2復合物結合，導致細胞的G1期阻滯，還與細胞周期蛋白A/CDK2結合而阻滯細胞于G2/M期;另一方面，p21還可與細胞增殖的速發(fā)早期基因增殖細胞核抗原、c-fos等結合阻斷DNA復制，抑制細胞增殖［4］。CCND1基因編碼的細胞周期蛋白D1蛋白過度表達可使細胞G1期縮短，細胞分裂速度加快而出現過度增殖。文獻報道人體多種惡性腫瘤都有細胞周期蛋白Dl過表達，包括頭頸部鱗癌、肝細胞癌及非小細胞肺癌等［5-6］。本研究CCND1基因表達下調可能與P53調控細胞周期、抑制細胞增殖有關。

細胞DNA損傷后，p53首先誘導細胞周期阻滯和DNA修復。如果損傷不能被修復，p53基因就通過下調抑制凋亡基因和上調促凋亡基因表達，誘導細胞凋亡。本研究rAd-p53導入后上調了FAS、TNFSF14、BAK1和TP53I3基因的表達，可能與p53誘導細胞凋亡有關。FAS基因即TNFRSF6，屬于TNF受體超家族成員。Fas與它的天然配體FasL結合是Fas在體內發(fā)揮作用的唯一途徑，也是細胞凋亡中最主要的途徑之一［7］。Fas與FasL結合可激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶半胱天冬酶家族的一系列酶聯(lián)反應，引起DNA降解和鏡下可見的細胞及細胞核的凋亡形態(tài)學改變。TNFSF14基因編碼的蛋白是TNF超家族 (TNFSF)第14個成員，具有促進細胞生長、分化或死亡的功能。Fan等［8］研究表明，NK細胞表面可表達TNFSF14的受體HVEM，TNFSF14與HVEM結合可促進NK細胞的激活、分化和IFN-γ的分泌。而NFSF14和IFN-γ協(xié)同可將Bcl-2從抗凋亡轉為親凋亡的形式，促進凋亡［9］。BAK1基因編碼的蛋白質屬于BCL-2蛋白家族，參與細胞凋亡的調變，是凋亡過程中一種重要的調節(jié)因子。TP53I3被p53誘導，參與p53介導的細胞死亡，編碼的蛋白質是醌氧化還原酶的同源類似物，與細胞對氧化和照射應激有關，參與細胞活性氧物質的代謝，可能通過調控活性氧參與細胞凋亡。

P53引起的MAD2L1和BTG2基因表達下調也可抑制細胞增殖。MAD2L1基因編碼的蛋白是細胞內的著絲粒相關蛋白—檢查點蛋白的重要組成成分，在細胞分裂監(jiān)控中具有關鍵作用［10-11］。MAD2基因的正常表達是保證細胞染色體正常分離的重要物質基礎［12］。MAD2基因表達下降，可能導致部分染色體分離遲滯，甚至可能導致細胞分裂減緩或停止，使細胞增殖抑制［13-14］。BTG2基因是抗增殖基因家族中的一個新成員，是細胞生長的“監(jiān)控器”。BTG2既可抑制周期素D1轉錄而降低其表達的蛋白水平，阻止細胞由G1期進入S期［15］，還可阻止周期素B1和CDC2的結合抑制CDC2激酶活性發(fā)揮作用，誘導細胞 G2 期的停滯［16］。

rAd-p53導入腫瘤細胞后，p53基因表達顯著上調，MDM2基因表達也顯著增加。MDM2是p53基因的靶基因，編碼核磷酸蛋白，主要通過與p53結合，形成p53-MDM2反饋環(huán)。p53基因表達上調后，誘導MDM2基因轉錄增強致使細胞中MDM2水平升高，并與p53結合形成復合物，從而抑制p53的轉錄激活。由于MDM2對p53的誘導凋亡和腫瘤抑制具有負反饋調節(jié)作用，提示可以在導入p53基因的同時，對MDM2的表達給予抑制，可能會進一步提高p53的抑瘤效果。

綜上，rAd-p53作為基因治療藥物，導入并上調p53基因表達后，通過改變包括細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡等一系列基因的表達，引起細胞周期阻滯、增殖抑制和凋亡增加，從而提高DDP對腫瘤的敏感性和殺傷效率。如果導入多個基因 (如p53協(xié)同基因)或抑制部分基因表達 (如MDM2基因)，可能進一步增加抑瘤效率。另外，p53基因表達上調后，還有一些基因的表達變化是腫瘤細胞生長抑制后造成，還是p53基因直接作用的結果，尚不十分清楚。同時，由于本研究只是在基因水平通過寡核苷酸芯片的方法對rAd-p53作用后腫瘤細胞中相關基因表達變化進行初步篩選，缺少重復和蛋白質水平的進一步驗證，因此，尚需要結合其他方法以及體內研究進一步證實。

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圖1 芯片雜交的偽色圖Fig 1 Pseudo-color map of gene chip hybridization