乙酰肝素酶在妊娠期高血壓疾病大鼠腎臟的表達(dá)及低分子量肝素干預(yù)治療

屈微 張延麗

(山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院婦產(chǎn)科 山西 太原 030001)

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的疾病,該病嚴(yán)重影響母嬰健康。目前認(rèn)為由高血壓狀態(tài)導(dǎo)致的全身及腎內(nèi)多種細(xì)胞因子、血管活性物質(zhì)等的改變?cè)谌焉锲诟哐獕杭膊≈衅鹬P(guān)鍵作用,這些異常改變導(dǎo)致多器官系統(tǒng)的損害(如腎臟、肝臟、心臟等),其中腎功能損害是其早期發(fā)病特征。發(fā)生機(jī)制尚不清楚,近年來研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成和降解失衡是各種原發(fā)性腎病或者繼發(fā)性腎病發(fā)生、發(fā)展的重要原因。乙酰肝素酶(HPA)作為細(xì)胞外基質(zhì)的降解酶,其表達(dá)變化可能是妊娠期高血壓疾病腎臟損害的重要原因。

臨床上無特效治療妊娠期高血壓疾病腎臟損害的藥物,有使用肝素治療的經(jīng)驗(yàn),但由于肝素易導(dǎo)致出血,故臨床無推廣,低分子量肝素(LMWH)是從普通肝素中提取出來的,具有出血副作用較少,生物利用度較高等特點(diǎn),生物作用主要為抗凝、擴(kuò)張血管、降低血壓、減少腎小球基底膜細(xì)胞的增殖、降低尿蛋白等。

本實(shí)驗(yàn)通過制備妊娠期高血壓疾病動(dòng)物模型并用LMWH進(jìn)行干預(yù)治療,觀察HPA在妊娠期高血壓疾病大鼠腎臟組織中的表達(dá)變化及LMWH的治療作用,并探討妊娠期高血壓疾病腎臟損害機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 wistar大鼠45只,均為12～14周齡(山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),用亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)造妊娠期高血壓疾病模型。

1.1.2 主要試劑 亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)(sigma公司)、低分子量肝素鈣注射液:6000IU/0.6mL、兔抗鼠乙酰肝素酶多克隆抗體、即用型鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)試劑盒,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒,磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01mol/L,pH7.4),枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液(0.01mol/L,pH6.0)(武漢博士德公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立 體重為250～400g、12～l4周齡的wistar雌性大鼠,按雌雄2:1合籠,每日清晨取雌鼠陰道分泌物涂片,發(fā)現(xiàn)精子計(jì)為妊娠第1天。將妊娠鼠隨機(jī)分為3組,每組15只。妊娠14d皮下注射L-NAME250mg/kg/d,建立妊娠期高血壓疾病模型組；妊娠14d皮下注射L-NAME(上午)同期皮下注射低分子量肝素(下午)600IU/kg建立低分子量肝素干預(yù)組；正常妊娠組注射等量的生理鹽水作為對(duì)照。3組均于妊娠第12天起每日測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈血壓,隔日收集24h尿量測(cè)定尿蛋白。

1.2.2 標(biāo)本收集 于妊娠21d將3組大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后行剖腹產(chǎn)手術(shù),取出腎臟組織,立即用生理鹽水洗凈,10%甲醛固定24h,石蠟包埋切片,厚4μm,免疫組織化學(xué)SABC法染色。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 腎臟組織標(biāo)本固定48h,常規(guī)脫水石蠟包埋,4um厚切片。將組織切片與兔抗鼠乙酰肝素酶抗體共孵化,4℃過夜,生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)處理后,滴加SABC,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,脫水、透明、封片。用PBS替代一抗做陰性對(duì)照,陽性組織呈棕黃色,陰性組織呈藍(lán)色。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):在放大400倍下,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,并用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)軟件計(jì)算其陽性區(qū)染色的光密度值(OD)進(jìn)行半定量分析,求其OD均值作為陽性表達(dá)的比較值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

妊娠期高血壓疾病大鼠于用藥第2天開始即出現(xiàn)高血壓、蛋白尿,結(jié)束分娩時(shí)伴有胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩等一系列病理學(xué)變化,與人類妊娠期高血壓疾病的癥狀相似。妊娠期高血壓疾病組大鼠的平均動(dòng)脈壓、尿蛋白明顯高于正常妊娠組,2組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而低分子量肝素干預(yù)組與妊娠期高血壓疾病組相比,可見平均動(dòng)脈壓、尿蛋白顯著降低,2組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但仍高于正常妊娠組水平,與正常妊娠組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1)

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

在妊娠期高血壓疾病組中,乙酰肝素酶在腎小球中表達(dá)較正常妊娠組明顯增強(qiáng),2組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在低分子量肝素干預(yù)組中,乙酰肝素酶在腎小球中的表達(dá)較妊娠期高血壓疾病組明顯減弱,2組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；仍較正常妊娠組的表達(dá)增強(qiáng),與正常妊娠組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表2)。

3 討論

乙酰肝素酶(HPA)是一種葡萄糖醛酸內(nèi)切酶,于D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖苷結(jié)合部位切斷硫酸乙酰肝素(HS)側(cè)鏈,使HS長(zhǎng)鏈逐段分解,釋放多種與HS結(jié)合的活性因子如:堿性成纖維生長(zhǎng)因子-2及其受體、血小板源性生長(zhǎng)因子,抗凝血酶Ⅲ,肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等,產(chǎn)生一系列生物反應(yīng)[1]。細(xì)胞外基質(zhì)主要成分中包含蛋白多糖及糖胺多糖,其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)[2],是一種蛋白聚糖類碳水化合物,由一個(gè)核心蛋白通過糖苷鍵和數(shù)個(gè)與之共價(jià)連接的HS側(cè)鏈組成。HSPG廣泛存在于有脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物組織ECM和細(xì)胞表面,它能與細(xì)胞表面及ECM中的活性分子結(jié)合,粘附于細(xì)胞表面,是ECM聚集和穩(wěn)定的基礎(chǔ)[3]。HS是HSPG的側(cè)鏈,其N-和O-特異性硫酸化不但賦予HS高密度的負(fù)電荷,而且賦予HS與其它細(xì)胞外基質(zhì)和生長(zhǎng)因子相互作用的能力[1～2]。HPA能夠切斷細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中HSPGs上的HS側(cè)鏈。

ECM構(gòu)成腎小球基底膜(GBM)的基本網(wǎng)絡(luò)狀框架結(jié)構(gòu)。蛋白尿的發(fā)生取決于腎小球?yàn)V過和腎小管重吸收,主要與腎小球的濾過功能有關(guān)。腎小球?yàn)V過膜由內(nèi)皮細(xì)胞層、GBM和足細(xì)胞及其裂孔隔膜共同組成,GBM是其中重要的一層,對(duì)分子的濾過依賴于分子的大小、形狀及所帶的電荷,其多陰離子位點(diǎn)已被陽離子探針?biāo)C實(shí)。乙酰肝素酶(HPA)是目前發(fā)現(xiàn)唯一能夠降解ECM中主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的蛋白水解酶。HPA在正常大鼠腎臟的腎小球不表達(dá),而小管上皮細(xì)胞呈低表達(dá)[4]。在出現(xiàn)大量蛋白尿時(shí)尿液中HS含量明顯增加[5]。蛋白尿的發(fā)生與GBM中HS側(cè)鏈的減少有關(guān),已經(jīng)證實(shí)在不同的人類蛋白尿性腎小球疾病,如:系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎、微小病變腎小球病、膜性腎病以及糖尿病腎病等GBM中HS的染色減少[6]。而隨著對(duì)蛋白尿發(fā)生機(jī)制的深入研究,人們發(fā)現(xiàn)在病理狀態(tài)下腎臟HPA的表達(dá)增高,突出表現(xiàn)在腎小球HPA的表達(dá)變化,說明HPA維持正常腎小管細(xì)胞的黏附與轉(zhuǎn)歸,而腎小球表達(dá)增高可能通過降解腎小球基底膜上的HS側(cè)鏈,導(dǎo)致ECM和基底膜結(jié)構(gòu)破壞,從而產(chǎn)生蛋白尿。腎臟組織中乙酰肝素酶的表達(dá)與妊娠期高血壓疾病腎臟損害的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

表1 各組大鼠結(jié)束分娩時(shí)平均動(dòng)脈壓和尿蛋白

表2 各組腎臟組織乙酰肝素酶陽性反應(yīng)光密度值

LMWH可顯著降低蛋白尿排泄率[7]?？赡芘c以下機(jī)制有關(guān):抑制HPA活性,進(jìn)而抑制HPA降解HS側(cè)鏈,保護(hù)ECM和基底膜結(jié)構(gòu)免受破壞；改善基底膜電荷屏障損傷,防止尿蛋白漏出；腎小球基底膜具有肝素受體,低分子肝素可能直接與該受體結(jié)合,代替HS發(fā)揮負(fù)電屏障作用阻止帶負(fù)電荷的蛋白由基底膜漏出[8]。低分子量肝素對(duì)妊娠期高血壓疾病腎臟損害具有一定的防治作用。

[1]Nagase H. Activation mechanisms of matrix metalloproteinases[J].BiolChem,1997,378(324):151～160.

[2]Denhardt DT ,Feng B ,Edwards DR,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinases(TIMP,aka EPA):structure,control of expression andbiological functions[J].Pharmacol Ther,1993,59(3):329～341.

[3]楊荊,白云凱.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子與腎臟疾病[J].云南醫(yī)藥,2005,26(1):60～61.

[4]Levidiotis V,Kanellis J,Ierino FL,et al.Increased expression of heparanase in puromycin am inonucleo side nephrosis[J].Kidney Int,2001,60(4):1287～1296.

[5]Mitsuhash i H,T sukada Y,Ono K,et al.Urine glycosaminoglycans and heparan sulfate excretion in adult patients w ith glomerular diseases[J].Clinical N eph ro logy,1993,39(5):231～240.

[6]Raats CJ,V an Den Bo rn J , Berden JH. Glomerular heparan sulfate alternation: M echanisms and relevance for proteinuria[J].Kidney Int,2000,57(2):385～400.

[7]Tamsma JT,Van der Woude FJ.Lemkes HHPJ.Effect of sulphated glycosa minoglycans on albuminueia in patients with overt diabetic nephropathy[J].Nephrol Dial Transplam,1996,11:182～185.

[8]Danne T,Spiro MJ,Spiro RG.Effect of high glucose on type collagen production by cultured glomerular epithelial,endothelial mesangial cells[J].diabetes,1993,42:170～177.