采后熱水處理對(duì)蘋果梨青霉病的抗性誘導(dǎo)

李紅霞，畢 陽，*，伍利芬，李科瑋，高雄杰

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

采后熱水處理對(duì)蘋果梨青霉病的抗性誘導(dǎo)

李紅霞1，畢 陽1，*，伍利芬2，李科瑋1，高雄杰1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

由擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是梨果實(shí)采后的主要病害。研究了采后45℃熱水浸泡15min處理對(duì)蘋果梨果實(shí)損傷接種P.expansum的誘抗效果及部分機(jī)理。結(jié)果表明：熱水處理后不同時(shí)間間隔（0、24、48h）接種病原物對(duì)果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)展抑制存在差異，其中以間隔48h的抑制效果最為明顯，接種后第4d的病斑直徑僅為間隔0h接種的33.2%，同樣，熱水處理后48h接種處理的病斑直徑也顯著低于同期的室溫水處理，其中以接種后第8d的差異最為明顯，為同期對(duì)照的68.7%。熱水處理可明顯提高損傷接種果實(shí)的PAL、POD和PPO活性，PAL活性在接種后第6d高出對(duì)照2.76倍，PPO活性在接種后第4d是對(duì)照的1.96倍，熱水處理還可有效增加損傷接種果實(shí)的總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量。上述結(jié)果表明，熱水處理可通過誘導(dǎo)果實(shí)的抗性來抑制蘋果梨損傷接種果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)展。

熱處理，果實(shí)，采后病害

蘋果梨是甘肅省名優(yōu)特產(chǎn)，但在采后貯運(yùn)過程中易受擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）侵染而發(fā)生青霉病，雖然采用化學(xué)殺菌劑可有效控制仁果類的青霉?。?］，但均存在農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和病原菌產(chǎn)生抗藥性等問題，因此急需尋找新的、更安全有效的控制方法［2］。采后熱處理具有無化學(xué)殘留、安全性高、便于操作等特性，可用于采后病害的控制［3］。據(jù)報(bào)道，采用熱空氣處理可顯著降低蘋果青霉病的病斑直徑及發(fā)病率［4-5］。但尚未見采后熱水處理對(duì)梨采后病害的控制報(bào)道。熱水處理的作用機(jī)理與其直接抑制病原物的生長和誘導(dǎo)產(chǎn)品產(chǎn)生抗性相關(guān)［2，6］。本文擬探討采后熱水處理對(duì)蘋果梨青霉病的誘抗效果，分析處理后果實(shí)體內(nèi)的抗性生化指標(biāo)變化，以豐富采后熱處理的誘抗機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試蘋果梨（Pyrus bretschneideri cv.Pingguoli）于2008年10月采自甘肅省國營張掖九公里園藝農(nóng)場，單果包紙，紙箱包裝后運(yùn)抵本校，室溫（18±2℃）下貯藏待用；供試P.expansum 分離于自然發(fā)病梨果實(shí)，PDA上保存待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熱水處理 選取大小均勻一致，無任何損傷果實(shí)在恒溫水浴鍋（HH-4金壇市榮華儀器制造有限公司江蘇）中45℃下浸泡處理15min，取出晾干后分別于0、24、48h后進(jìn)行損傷接種。每處理用果實(shí)6個(gè)，重復(fù)3次。

1.2.2 果實(shí)損傷接種 孢子懸浮液的配置參照劉紅霞等方法并修改［7］。先將28℃下在PDA上培養(yǎng)4d的P.expansum孢子用含0.01%Tween-80的無菌水用玻璃棒刮下，然后轉(zhuǎn)入50mL三角瓶中，在混合器上振蕩15s，再用雙層紗布過濾，濾液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)算出孢子懸浮液的濃度，最后稀釋至所需濃度（2 ×106個(gè)/mL）。

果實(shí)經(jīng)75%酒精表面消毒后，用滅菌鐵釘（直徑3mm）在表面等距離刺孔8個(gè)（深3mm，其中赤道部位4個(gè)，上下萼洼附近各處2個(gè)），取20μL上述孢子懸浮液接入孔內(nèi)。稍作晾干后入包裝箱，塑料薄膜覆蓋保濕，于（18±2）℃，RH 85%～90%下貯藏觀測病斑直徑。

1.2.3 生化分析取樣 參照Bi等方法［8］并修改。取熱水處理后48h接種果實(shí)于處理后0、2、4、6、8、10d削取病斑以外3～5mm處的果皮1g，用直徑5mm打孔器打取病斑以外3～5mm處皮下2～3mm處果肉組織3g。鋁箔紙包裹，液氮冷凍，在-80℃超低溫冰箱中保存待用，以室溫水處理48h后接種為對(duì)照。

1.2.4 抗性酶活性測定

1.2.4.1 苯丙氨酸解氨酶（Phenylalnine ammonialyase，PAL）活性測定 參照 Assis方法［9］并修改。在290nm下測定吸光度變化，以每小時(shí)內(nèi)A290變化0.01為1個(gè)活性單位（U）。酶活性單位為U/mg protein。

1.2.4.2 過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性的測定

參照Chance and Maehly方法［10］并修改。酶活性以每分鐘A470變化0.01為1個(gè)活性單位（U），表示為U/mg protein。

1.2.4.3 多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活性測定 參考Chen等方法［11］并改進(jìn)。酶活性以每分鐘A525變化0.01為1個(gè)活性單位（U），表示為U/mg protein。

1.2.5 苯丙烷代謝產(chǎn)物含量測定

1.2.5.1 總酚和類黃酮含量測定 參照 Pirie and Mullins方法［12］并修改。分別于280nm和325nm測定總酚和類黃酮含量?？偡雍恳訟280/g FW表示；類黃酮含量以A325/g FW表示。

1.2.5.2 木質(zhì)素含量測定 參照 Morrison方法［13］并修改。在280nm下測定吸光度，木質(zhì)素含量以A280/g FW表示。

1.2.6 蛋白含量測定 參照Bradford方法測定［14］，以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白含量，上述各項(xiàng)生化分析均設(shè)平行樣6個(gè)，重復(fù)3次。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 病斑直徑數(shù)據(jù)處理用 Microsoft Excel 2003和DPS3.01數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SE）并進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著分析，其余數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SE）。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱水處理后不同時(shí)間間隔和不同溫度處理后48h損傷接種P.expansum對(duì)病斑直徑的影響

熱水處理后不同時(shí)間間隔接種病原物對(duì)果實(shí)病斑直徑的影響存在差異。以間隔0h接種病斑直徑最大，間隔24、48h后接種均能夠顯著抑制病斑直徑的擴(kuò)展，其中以間隔48h的效果最為明顯，不僅在接種后的10d內(nèi)病斑直徑均顯著低于0h接種，而且接種后第2d和4d的病斑直徑僅是0h接種的39.8%和33.2%（圖1A）。同樣，熱水處理后48h接種處理的病斑直徑也顯著低于同期的室溫水處理對(duì)照，其中以接種后第6d和8d的差異最為明顯，分別為同期對(duì)照的73.2%，68.7%（圖1B）。

圖1 熱水處理后不同時(shí)間間隔（A）和不同溫度處理后間隔48h（B）損傷接種P.expansum對(duì)病斑直徑的影響

2.2 熱水處理對(duì)果實(shí)體內(nèi)3種抗性酶活性和3種抗性物質(zhì)含量的影響

熱處理可以顯著提高果實(shí)體內(nèi)的3種抗性酶活性，其中以PAL變化最為明顯。在培養(yǎng)期間處理和對(duì)照的PAL的活性均呈單峰形變化，但處理果實(shí)的PAL活性始終明顯高于對(duì)照，在第6d差異達(dá)到最大，比對(duì)照高出2.76倍（圖2A）。同樣，熱處理也明顯提高了果實(shí)的POD和PPO活性，處理組的PPO在前4d迅速上升，在第8d達(dá)到最大值，后迅速下降，而對(duì)照組在前6d緩慢上升且在第6d達(dá)到最大酶活，在第4d時(shí)差異最顯著，處理組活性是對(duì)照的1.96倍，但是處理組始終高于對(duì)照。POD的活性變化與PPO基本一致（圖2B，2C）。

熱處理可以在一定程度上提高梨果實(shí)體內(nèi)的總酚和木質(zhì)素含量，其中以木質(zhì)素含量變化較為明顯（圖2F）?？偡雍砍颂幚砗蟮?d和10d外，均高于對(duì)照（圖2D），熱水處理還有效提高了類黃酮含量（圖2E）。

3 討論

熱水處理后48h果實(shí)損傷接種P.expansum的病斑直徑顯著低于室溫水處理的對(duì)照（圖1B），表明熱處理可以通過誘導(dǎo)果實(shí)體內(nèi)的抗病性來有效抑制病斑直徑的擴(kuò)展。熱水處理后間隔48h損傷接種P.expansum的病斑直徑顯著低于間隔0h和24h（圖1A），說明熱水處理對(duì)果實(shí)抗病性的誘導(dǎo)具有周期性。PAL、POD和PPO活性，以及總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量是指示果實(shí)抗病性是否被誘導(dǎo)的重要生化指標(biāo)［4］。熱水處理后果實(shí)體內(nèi)的PAL、POD和PPO活性明顯提高，以及總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量的增加（圖2），表明熱水處理激活了果實(shí)體內(nèi)的抗性生化反應(yīng)［4］。該結(jié)果與邵興峰等的研究結(jié)果基本一致［4］。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的第一關(guān)鍵酶，它與酚類物質(zhì)、木質(zhì)素及植保素等抗病物質(zhì)的合成有關(guān)，該酶活性越高，說明果實(shí)的抗病性越強(qiáng)［15］。PPO可使果實(shí)體內(nèi)積累的酚類物質(zhì)氧化成高毒性的醌類物質(zhì)，進(jìn)而起到對(duì)病原物的毒殺作用，從而抑制病原物的生長［16］。POD可催化酚類物質(zhì)的前體聚合為木質(zhì)素，起到加固植物細(xì)胞壁、抵抗病原物侵襲的作用，還是細(xì)胞內(nèi)清除自由基的保護(hù)酶。熱水處理提高了POD活性，有利于木質(zhì)素和植保素的合成，增加了細(xì)胞壁的抗病能力［17］。熱水處理還顯著提高了梨果實(shí)內(nèi)三種重要的抗性物質(zhì)總酚、類黃酮和木質(zhì)素的含量，從而提高了梨果實(shí)的抗病性。類黃酮作為植物保衛(wèi)素具有抑制真菌孢子萌發(fā)、芽管伸長、菌絲生長作用［18］。酚類物質(zhì)在PPO作用下可氧化成能對(duì)病原菌產(chǎn)生直接毒性的醌類物質(zhì)，能有效抑制病原菌的擴(kuò)展［16］。木質(zhì)素可形成阻止病原物侵入寄主的機(jī)械屏障，加強(qiáng)了寄主抗真菌的能力［19］。

綜上所述，熱水處理對(duì)蘋果梨青霉病的抑制與其增強(qiáng)果實(shí)體內(nèi)的苯丙烷代謝密切相關(guān)。此外，還有一些其他的抗性機(jī)理涉及其中，尚需進(jìn)一步探討。

圖2 熱水處理和P.expansum挑戰(zhàn)接種對(duì)果實(shí)體內(nèi)PAL（A）、POD（B）和PPO（C）活性以及總酚（D）、類黃酮（E）和木質(zhì)素（F）含量的影響

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Post-harvest hot water treatment induces resistance against Penicillium expansum in pear fruit

LI Hong-xia1，BI Yang1，*，WU Li-fen2，LI Ke-wei1，GAO Xiong-jie1
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.College of Agronomy，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Blue mold caused by Penicillium expansum was a major post-harvest disease in pear.lnduction resistance effect and partial mechanisms of post-harvest hot water dipping in 45℃ for 15min against blue mold inoculated with P.expansum in pea（rcv.Pingguoli）were investigated.The results showed that different inoculation interva（l0，24，48h）after hot water treatment had a difference lesion diameter.The interval of 48h had the smallest lesion diameter，which was 33.2%of 0h interval.Meanwhile hot water treatment at interval 48h inoculation had a smaller lesion diameter，and was 68.7%of the control after 8d of inoculation.Hot water treatment significantly enhanced the activity of phenylalnine ammonialyase（PAL）peroxidase（POD）and polyphenol oxidase（POD）in fruit inoculated with P.expansum.The activity of PAL and PPO were 2.76 and 1.96 times higher than the control after 6d and 4d of inoculation.Hot water treatment also increased the content of total phenolics flavonoid and lignin.lt is suggested that hot water treatment inhibits the lesion diameter of pear fruit inoculated with P.expansum by induction resistance.

hot water treatment；fruit；post-harvest disease

TS255.3

A

1002-0306（2010）11-0329-03

2009-11-04 *通訊聯(lián)系人

李紅霞（1982-），女，在讀碩士，研究方向：果蔬防腐與保鮮。

國家支撐計(jì)劃（2006BAD22B02）。