金葉女貞果實中齊墩果酸的提取與測定

王建安，王慧云，李艷芝，劉玉鳳，楊 濤

（濟寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東日照276826）

金葉女貞果實中齊墩果酸的提取與測定

王建安，王慧云*，李艷芝，劉玉鳳，楊 濤

（濟寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東日照276826）

目的：以金葉女貞果實為原料，優(yōu)化超聲提取其中齊墩果酸的最佳工藝。方法：以齊墩果酸含量為考察指標，在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交設(shè)計實驗，以乙醇濃度、超聲時間、超聲功率、料液比4因素進行正交實驗，優(yōu)化超聲波提取金葉女貞果實中齊墩果酸的工藝，并采用紫外分光光度法測定其含量。結(jié)果：在實驗影響因素中，影響程度從大到小依次為超聲功率＞超聲時間＞乙醇濃度＞粒度；最佳提取工藝為乙醇濃度50%，超聲時間80min，超聲功率400W，粒度40目，連續(xù)提取兩次，此時齊墩果酸得率最高，并確定最佳采收時期為秋季。結(jié)論：采用此工藝提取方法快速、簡單，可以為進一步研究金葉女貞提供參考。

金葉女貞，齊墩果酸，超聲波，分光光度法，提取工藝

金葉女貞（Ligustrum Lucidum cv.）為木犀科女貞屬常綠小灌木，是由加州金邊女貞與歐洲女貞雜交育成的［1］，目前尚無其化學(xué)成分及藥用價值報道。其同屬植物女貞（Ligustrum Lucidum Ait.）的干燥成熟果實女貞子為常用中藥［2-3］，其主要成分為齊墩果酸（OA）。OA為五環(huán)三萜類化合物，為白色針狀結(jié)晶，無味，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚、丙酮等有機溶劑［4］，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成困難，因此國內(nèi)外均從植物中提取。齊墩果酸主要具有護肝降酶、促進肝細胞再生、抗炎、強心、利尿、抗腫瘤等作用，還具有降血糖、降血脂、鎮(zhèn)靜的作用［5］，是開發(fā)治療肝病和降血糖等藥物的有效成分，目前臨床上齊墩果酸片等抗肝炎藥即是以此研制的。并且由于其廣泛的生物學(xué)活性，歐美國家現(xiàn)已將其作為天然抗氧化劑應(yīng)用到食品中［6］。目前齊墩果酸主要從木犀科植物齊墩果（OLea europaea L.）的葉、女貞（Ligustrum Lucidum Ait.）果 實 及 連 翹［Forsythia suspensa（Thunb.）VahL.］的果實等提取獲得。但未見有對金葉女貞中提取此類物質(zhì)的報道。為進一步研究和開發(fā)利用新的藥用植物資源，本文首次通過超聲波輔助法從金葉女貞果實中提取其中齊墩果酸，在單因素實驗的基礎(chǔ)上研究了超聲提取過程中相關(guān)條件對齊墩果酸提取率的影響，為優(yōu)化金葉女貞中齊墩果酸的提取工藝進行了探索，旨在建立一種快速、簡便、有效的提取方法，為今后該產(chǎn)品的進一步研究開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藥材 采集于濟寧醫(yī)學(xué)院日照校區(qū)院內(nèi)，經(jīng)鑒定為木犀科女貞屬植物金葉女貞的果實，去除果柄等雜物后，60℃烘干備用；濃硫酸、冰醋酸、石油醚、無水乙醇、甲醇、香蘭素等 均為分析純；齊墩果酸標準品 購自中國藥品生物制品鑒定所（編號110709-200505）。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，LD-02型高速中藥粉碎機，電子分析天平，Q-4110石英狹縫比色皿等。

1.2 實驗方法

1.2.1 齊墩果酸含量的測定

1.2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對照品5.07mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即每 1mL中含齊墩果酸0.507mg，搖勻即得。

1.2.1.2 檢測波長的選擇 按照王立業(yè)方法［7］，略作改進，取齊墩果酸對照品溶液0.8mL置于25mL具塞試管中，揮干，加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，再加入5mL 60%H2SO4，60℃水浴反應(yīng)20min，取出后立即用冷水冷卻10min以終止反應(yīng)，以不加對照品的溶液做空白，在200～700nm波長范圍內(nèi)進行紫外全波長掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長在532nm處。

1.2.1.3 標準曲線的繪制［8］分別精密量取標準溶液0.0（空白對照）、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL（相當于濃度0.0000、0.3042、0.4056、0.5070、0.6084、0.7098、0.8112mg·mL-1）置于具塞試管中。按1.2.1.2項下方法處理，應(yīng)用UV-win5.0軟件測定各溶液的吸光度。以濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y），繪制標準曲線（結(jié)果見圖1），得齊墩果酸標準溶液濃度X與吸光度值Y關(guān)系曲線的回歸方程式：Y= 1.0041X+0.2990，R2=0.9991。

圖1 齊墩果酸標準曲線

1.2.1.4 精密度實驗 取5份供試液各0.2mL，按

1.2.1.2 項下法處理，在532nm處測定其吸光值，計算齊墩果酸含量，得RSD=0.02138%（n=6），表明本法精密度良好，儀器穩(wěn)定性較好。

1.2.1.5 穩(wěn)定性實驗 取5份供試液各0.2mL，按

1.2.1.2 項下法處理，在12h內(nèi)每1h測量一次，計算齊墩果酸含量，計算結(jié)果為RSD=0.8%（n=14），表明供試品液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好，也可說明齊墩果酸在12h內(nèi)較穩(wěn)定，顯色較好。

1.2.1.6 重現(xiàn)性實驗 取5份供試液各0.2mL，按

1.2.1.2 項下法處理，在532nm處測定其吸光值，計算齊墩果酸含量，結(jié)果RSD=0.4%。

1.2.1.7 加樣回收實驗 精密稱取已測定的樣品粉末2.5g，共6份，采用加樣回收率法，加已知含量的齊墩果酸對照品適量依法測定，計算回收率。結(jié)果齊墩果酸平均回收率為99.26%，RSD=0.6%（n=6）。

1.2.1.8 齊墩果酸得率計算 公式如下：

式中，C：測定液齊墩果酸質(zhì)量濃度，mg·mL-1；W：稱取藥材量，g；V：提取溶液體積，mL。

1.2.2 金葉女貞果實中齊墩果酸的提取工藝的優(yōu)選

為系統(tǒng)考察超聲法提取金葉女貞果實中齊墩果酸的工藝參數(shù)，根據(jù)多次單因素實驗的結(jié)果，擬選用乙醇濃度（A）、提取時間（B）、超聲功率（C）、粒度（D）作為考察因素，以樣品中齊墩果酸含量為考察指標，采用4因素3水平正交表，即L9（34）正交表進行實驗，各因素及水平設(shè)置如表1所示。

表1 因素水平表L9（34）

準確稱取干燥至恒重的藥材5.00g，按L9（34）正交設(shè)計的方案下進行3次重復(fù)實驗。每次加入相應(yīng)濃度的乙醇75mL，超聲提取2次，合并提取液，50℃減壓濃縮至干，用石油醚萃取2次，過濾蒸干，用甲醇定容至10mL，取1mL置于具塞試管中，揮干，然后按1.2.1.2項下方法測定吸光度值，帶入齊墩果酸標準曲線方程得出質(zhì)量濃度，然后計算各提取液中齊墩果酸的得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實驗結(jié)果

根據(jù)對實驗結(jié)果進行極差分析（表2）可以看出影響金葉女貞果實得率的因素依次為：超聲頻率（C）＞提取時間（B）＞乙醇濃度（A）＞粒度（D），最佳組合為A1B3C2D3，即粒度為40目，乙醇濃度為50%，超聲時間為80min，超聲功率300W，連續(xù)提取2次，在此條件下齊墩果酸得率最高，含量達到1.2409mg·g-1。

表2 正交實驗結(jié)果

經(jīng)方差分析表明（見表3），超聲功率與超聲時間對齊墩果酸提取率具有顯著的影響（P＜0.05），而粒度與乙醇濃度則均未達到顯著水平（P＞0.05）。

表3 正交實驗方差分析表

2.2 驗證性實驗

按照選定的最佳提取方案進行三次平行實驗，結(jié)果其平均得率為0.98%，高于正交實驗中任何一組的得率，證明所選工藝可行。

2.3 不同采收時期齊墩果酸含量的比較

分別對秋季及春節(jié)后采收的兩批材料進行實驗，實驗結(jié)果表明，秋季采收的含量為1.19mg·g-1，而春節(jié)后采收的含量為0.98mg·g-1，這表明今后在選擇采收時應(yīng)以秋季采收為宜。

3 結(jié)論

本文在多次單因素實驗基礎(chǔ)上進行了多因素正交實驗，研究了超聲波法輔助提取金葉女貞中齊墩果酸的最佳工藝。超聲波通過超聲化作用產(chǎn)生強烈振動、空化效應(yīng)及攪拌作用，使局部升溫和局部高壓，破壞植物組織結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生局部粉碎作用，強化提取過程，具有提取速度快、得率和純度較高的優(yōu)點［9-10］。

從正交實驗的直觀分析和方差分析可知，影響因素的主次順序為超聲頻率＞提取時間＞乙醇濃度＞粒度。并確定最佳工藝為乙醇濃度50%，超聲時間80min，超聲功率300W，粒度40目，連續(xù)提取兩次，此時得率達到最高；另外，由實驗結(jié)果得知最佳采收時間為秋季，這也與大多數(shù)果實類藥材的采收時間相一致，為今后從植物資源中提取齊墩果酸提供了新的思路。

齊墩果酸分析方法目前主要采用高效液相色譜法（HPLC）［11］、薄層色譜法（TLC）［12］、氣相色譜法（GC）［13］及毛細管電泳（CE）［14］等方法，其中TLC法的實驗條件最容易達到，但結(jié)果的重現(xiàn)性較差；GC法因需要衍生化，故操作復(fù)雜，回收率也不高；HPLC法的測定條件最為成熟，但設(shè)備相對較為昂貴。本實驗采用紫外分光光度法進行測定，從實驗結(jié)果表明，本法操作簡便，測定結(jié)果準確、快速，具有良好的重現(xiàn)性，且所需設(shè)備、試劑低廉易得，今后可作為該類物質(zhì)及其制劑的的質(zhì)量控制方法。

化學(xué)成分含量的差別與生長的環(huán)境關(guān)系密切，擬在今后收集不同產(chǎn)地的金葉女貞果實進行含量的比較，并進一步進行藥理學(xué)實驗，為今后的開發(fā)提供有力的理論依據(jù)。

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Extractiion and determinnation of oleanolic acid from Ligustrum Lucidum cv.

WANG Jian-an，WANG Hui-yun*，LI Yan-zhi，LIU Yu-feng，YANG Tao
（SchooL of PharmaceuticaL Science，Jining Medical University，Rizhao 276826，China）

Objective：To optimize extraction condition of oleanolic acid from the fruit of Ligustrum Lucidum cv.by ultrasound wave.Methods：With oleanolic acid as index，based on single factor test，using L（934）orthogonal test，the effects of ethanol concentration，partical sizes，ultrasonic power and extracting time were considered.The contents of oleanclic acid were determined by UV-spectrophotometry.Results：The order of factors to affect the oleanolic acid extraction would activate by ultrasonic power，extraction time，ethanol oncentration，partical sizes.The optimum ultrasonic extractions were as follows：50%ethanol solution as extraction solvent，ultrasonic power 300W，extraction time 80min and treating with ultrasonic for twice repeatedly，the contents of oleanolic acid was the highest.And the best harvest time was autumn.Conclusion：The optimized technology is quick and simple，and can be used as theoretical basic of Ligustrum Lucidum cv.

Ligustrum Lucidum cv.；oleanolic acid；ultrasonic wave；spectrophotometric methods；extracting technics

TS255.1

B

1002-0306（2010）11-0301-03

2009-11-11 *通訊聯(lián)系人

王建安（1972-），男，碩士，講師，主要從事藥用植物資源與活性成分研究。