兩種不同離子層析法分離雞蛋溶菌酶的比較研究

張新寶，陳紅兵，高金燕

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047；3.南昌大學(xué)食品系，江西南昌330047）

兩種不同離子層析法分離雞蛋溶菌酶的比較研究

張新寶1，2，陳紅兵1，2，高金燕1，3，*

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047；3.南昌大學(xué)食品系，江西南昌330047）

以雞蛋溶菌酶的主要分離方法—陽(yáng)離子交換法與陰離子交換法為對(duì)象，從分離的回收率、雞蛋溶菌酶純度以及樣品處理周期等方面進(jìn)行比較研究。研究結(jié)果顯示，兩種方法均能較好地分離雞蛋溶菌酶。陰離子交換法分離出的雞蛋溶菌酶純度更高，純度＞90%，并且分離周期短，操作更方便，但其回收率為20.7%，而陽(yáng)離子交換法的為31.1%，陰離子交換法更適合于制備高純度的蛋清溶菌酶。

溶菌酶，離子層析，分離純化

雞蛋溶菌酶因其天然的殺菌抑菌作用而作為一種食品防腐劑被廣泛應(yīng)用于各類食品行業(yè)之中，并且，它僅由一條多肽鏈組成，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，歷來(lái)作為一種模式蛋白被用來(lái)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，因此，雞蛋溶菌酶分離純化工作一直不斷受到許多科研工作者的青睞。雞蛋溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17），又稱N-乙酰胞壁質(zhì)酶，是一種專門作用于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的水解酶，由129個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其分子量約為14.3kDa。因雞蛋溶菌酶含有大量的組氨酸、精氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺以及天冬氨酸等堿性氨基酸，其等電點(diǎn)pI為10.7，為典型的堿性蛋白質(zhì)，在酸性或近中性環(huán)境中帶有大量的正電荷，能選擇性吸附在陰離子交換分離介質(zhì)上，從而與蛋清中其他蛋白質(zhì)分離開來(lái)。因此，陽(yáng)離子交換法在分離雞蛋溶菌酶上更容易受到關(guān)注，其中已有大批科研工作者從分離介質(zhì)的選擇、不同因素對(duì)雞蛋溶菌酶分離效果的影響、工藝過(guò)程控制等方面對(duì)陽(yáng)離子交換法做了深入研究［1-6］，尤其以Xue等人研究得出的分離條件較為成熟［7］。另外，還有極少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道使用陰離子交換樹脂分離溶菌酶。來(lái)自吉林大學(xué)的李欣使用DEAE-纖維素陰離子交換柱法分離蛋清溶菌酶，以pH10.0的Tris緩沖液作為洗脫液［8］。但至今還未見有文獻(xiàn)報(bào)道比較研究以上兩種分離方法的優(yōu)劣之處，因此，本研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，分別對(duì)這兩種分離方法進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)而比較研究它們?cè)诜蛛x雞蛋溶菌酶上的分離效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮雞蛋 購(gòu)于市場(chǎng)；雞蛋溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品 電泳純級(jí)，sigma公司；牛血清白蛋白 電泳純，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究院；其他常用生化試劑 分析純。

柱材CM-葡聚糖陽(yáng)離子凝膠樹脂、DEAE-葡聚糖陰離子凝膠樹脂 法碼西亞公司；恒流泵HL-2、自動(dòng)部分收集器BSZ-160、TH-500A梯度混合器上海青浦滬西儀器廠；HD-93-1型紫外檢測(cè)儀 上海金達(dá)生化儀器廠；垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司；分蛋器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋清預(yù)處理 取新鮮雞蛋，先洗凈，在蛋殼一端破殼，分蛋器分離蛋清，加入等體積的蒸餾水，輕輕攪拌均勻，以不起氣泡為宜，再用三層紗布過(guò)濾不溶物，調(diào)節(jié)蛋清濾液 pH至6.1，4℃冰箱靜止5h，3000r/min離心5min，過(guò)濾除去沉淀物，再調(diào)pH至4.5，同樣條件下靜止5h，過(guò)濾除去沉淀物，將濾液放于-20℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 CM-陽(yáng)離子交換法分離溶菌酶 參照Timothy D等人的實(shí)驗(yàn)方法［4］，對(duì)其稍作改進(jìn)。首先將CM-葡聚糖凝膠G-50經(jīng)酸、堿預(yù)處理，裝柱，水洗至中性，然后用濃度為0.05mol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液平衡3～4h，直至核酸蛋白檢測(cè)儀數(shù)值穩(wěn)定下來(lái)，然后上樣5mL，再用含0.5mol/L NaCl的上述磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，控制流速為1.5mL/min，依據(jù)記錄儀記錄下的洗脫峰收集洗脫液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DEAE-陰離子交換法分離溶菌酶 經(jīng)過(guò)預(yù)處理的DEAE-葡聚糖凝膠裝柱后，先用蒸餾水洗至中性，然后用pH7.5的Tris緩沖液平衡3～4h至核酸蛋白檢測(cè)儀數(shù)值恒定，經(jīng)調(diào)零后，上樣5mL，繼續(xù)用上述Tris緩沖液，采用與步驟1.2.2相同的流速條件進(jìn)行洗脫，待穿過(guò)峰洗脫下來(lái)后，立即改用含1.2mol/L NaCl的Tris緩沖溶液進(jìn)行洗脫，收集穿過(guò)峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 SDS-PAGE鑒定蛋白成分及純度 參照《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與方法》，通過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定上述兩種分離法分離得到的樣品中蛋白成分。本實(shí)驗(yàn)采用15%的分離膠和5%的濃縮膠，使用考馬斯亮藍(lán)法染色，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白maker（11～170kDa，Sigma）確定蛋白質(zhì)分子量，同時(shí)與1mg/mL的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品做電泳比對(duì)，確定分離樣品的純度。

1.2.5 溶菌酶回收率的測(cè)定 參照Folin-酚法，分別測(cè)定兩種方法分離得到的樣品中蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算蛋清溶菌酶回收率。以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 CM-陽(yáng)離子交換法分離溶菌酶

CM-陽(yáng)離子交換法分離雞蛋蛋清溶菌酶如圖1（A）所示。該方法將蛋清蛋白分離為三個(gè)峰，它們之間都有一定的間隔，說(shuō)明后面的兩種蛋白質(zhì)得到了很好的分離，從后面的SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）得知，峰Ⅲ對(duì)應(yīng)的樣品為溶菌酶，計(jì)算其分離度R=2.53，說(shuō)明CM-陽(yáng)離子交換法能夠?qū)㈦u蛋溶菌酶很好地分離開來(lái)。

圖1 離子交換法分離雞蛋溶菌酶洗脫曲線

2.2 DEAE-陰離子交換法分離溶菌酶

圖1（B）所示為陰離子交換法分離溶菌酶的洗脫曲線，從圖可以看出，雞蛋蛋清蛋白僅被分離為峰Ⅰ和峰Ⅱ兩部分，它們之間間隔顯著，其分離度R= 4.4，也說(shuō)明這兩種蛋白質(zhì)被充分的分離開來(lái)。圖2的電泳結(jié)果顯示峰Ⅰ對(duì)應(yīng)的樣品為蛋清溶菌酶。通過(guò)A、B兩條洗脫曲線，我們可以看出，使用陰離子交換法僅需要30體積的洗脫液就能夠?qū)㈦u蛋溶菌酶從蛋清蛋白中分離開來(lái)，較陽(yáng)離子交換法少用大約15體積的洗脫液，既省時(shí)，又省料。

2.3 SDS-PAGE鑒定蛋白質(zhì)成分

圖2為SDS-PAGE電泳圖。與蛋白marker相比較，陽(yáng)離子交換法中峰Ⅲ和陰離子交換法中的峰Ⅰ對(duì)應(yīng)的樣品D1、D2在電泳泳道的下部都出現(xiàn)了一清晰的條帶，蛋白質(zhì)分子量約為14kDa，可以確定該蛋白質(zhì)為雞蛋溶菌酶。與電泳純?nèi)芫笜?biāo)準(zhǔn)品S（純度＞90%）相比較，陰離子交換法分離得到的樣品D1中僅含有一個(gè)條帶，可以說(shuō)明該方法分離得到的雞蛋溶菌酶純度＞90%，而用陽(yáng)離子交換法分離得到的樣品D2經(jīng)SDS-PAGE電泳后，泳道中還出現(xiàn)了一條暗淡的條帶N，說(shuō)明其中還含有少量的雜質(zhì)。因此，陰離子交換法分離得到的樣品純度更高。

2.4 溶菌酶回收率

兩種方法分離得到的蛋清溶菌酶樣品的蛋白濃度及蛋清溶菌酶回收率如表1所示。雞蛋溶菌酶約占蛋清總蛋白的3.4%［9］，以此為依據(jù)計(jì)算得這兩種方法分離得到的蛋清溶菌酶的回收率分別達(dá)31.1%和20.7%，高于Xue等人所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)20%。

表1 兩種離子交換所得雞蛋溶菌酶回收率對(duì)照表

圖2 SDS-PAGE電泳圖

3 討論

研究結(jié)果顯示，這兩種蛋清溶菌酶的分離方法都取得了較好的分離效果。對(duì)比Xue等人的洗脫曲線（圖1 C），這兩種方法分離得到的洗脫峰比較集中，洗脫體積小，省時(shí)又省料，并且分離出的洗脫峰少，僅僅是將蛋清溶菌酶分離開來(lái)，雜蛋白基本都集中在一起，有利于其他雜蛋白的再利用，提高資源利用率，非常適合于雞蛋溶菌酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

但是對(duì)比研究這兩種分離方法會(huì)發(fā)現(xiàn)，它們的分離效果仍然有很大差別。雖然陽(yáng)離子交換法也能夠?qū)⒌扒迦芫概c其他雜蛋白分離開來(lái)，但是從圖2可以發(fā)現(xiàn)，其中仍然含有少量的雜蛋白，這與Xue等人采用陽(yáng)離子交換法粗分離蛋清溶菌酶得到的結(jié)果一致，其中的原因可能是蛋白與分離介質(zhì)之間不僅有正負(fù)離子的相互作用，還有一定的范德華力，使得少量雜蛋白不能經(jīng)磷酸鹽緩沖液完全洗脫下來(lái)，而在后來(lái)的鹽離子競(jìng)爭(zhēng)作用下隨溶菌酶一起洗脫下來(lái)。陰離子交換法分離溶菌酶曲線顯示，蛋清溶菌酶的分離度R=4.4，遠(yuǎn)大于陽(yáng)離子交換法的分離度，并且陰離子交換法分離得到的溶菌酶通過(guò)SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)有雜蛋白，說(shuō)明其純度較陽(yáng)離子交換法有明顯提高，接近或超過(guò)電泳純級(jí)蛋清溶菌酶標(biāo)品的純度（＞90%）。另外，從兩種離子層析洗脫曲線上，我們也可以看出陰離子交換法的樣品分離周期更短，僅為陽(yáng)離子交換法的66.7%左右。

在計(jì)算雞蛋溶菌酶回收率時(shí)，我們以Stevens等人報(bào)道雞蛋溶菌酶占蛋清總蛋白的比例為依據(jù)粗略計(jì)算出其回收率［9］。計(jì)算結(jié)果表明，陽(yáng)離子交換法制備的溶菌酶回收率要高于陰離子交換法，究其原因，陽(yáng)離子交換介質(zhì)幾乎吸附了蛋清上樣液中所有的雞蛋溶菌酶，在后來(lái)的高鹽離子競(jìng)爭(zhēng)作用下被完全洗脫下來(lái)；而用陰離子交換介質(zhì)分離時(shí)，有部分溶菌酶通過(guò)分子間范德華力被吸附在分離介質(zhì)上沒有隨穿過(guò)峰一起洗脫下來(lái)，而在隨后的介質(zhì)再生過(guò)程中與雜蛋白一起被洗脫下來(lái)，致使部分雞蛋溶菌酶損失，故其回收率遠(yuǎn)低于陽(yáng)離子交換法的31.1%，但仍與Xue等人報(bào)道的20%的回收率基本一致。

總結(jié)以上兩種分離方法，我們可以發(fā)現(xiàn)，陰離子交換法程序相對(duì)簡(jiǎn)單、洗脫時(shí)間短、蛋白純度高，更適合于制備高純度的蛋清溶菌酶。

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Comparison of two different ion chromatography methods in purification of egg white lysozyme

ZHANG Xin-bao1，2，CHEN Hong-bing1，2，GAO Jin-yan1，3，*
（1.State Key Laborary of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；
2.Sino-German Joint Research Institude，Nanchang University，Nanchang 330047，China；3.Department of Food Science，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Anion chromatography and cation chromatography，which were the major methods in separating egg lysozyme，were investigated to compare their difference in the recovery rate，the resulting purity of lysozyme，and the time needed in separating the samples.Results showed both of the two methods could separate egg white lysozyme effectively.Specifically，the result of anion chromatography showed a higher purity，which was more than 90%.And it was also much more convenient and time-saving.However，the recovery rate was 20.7%，less than that of cation chromatography which was 31.1%.So anion chromatography was more preferable to purify egg white lysozyme with high purity.

lysozyme；ion chromatography；purification

TS201.2+5

B

1002-0306（2010）11-0283-03

2009-10-26 *通訊聯(lián)系人

張新寶（1980-），男，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-08-07-04）；江西省自然科學(xué)基金（2008GZN0040）；南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索項(xiàng)目（SKLF-TS-200820）。