糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌PCR檢測(cè)方法的建立

段麗莉

（吉林省吉林市疾病預(yù)防控制中心微生物科，吉林吉林 132001）

糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌PCR檢測(cè)方法的建立

段麗莉

（吉林省吉林市疾病預(yù)防控制中心微生物科，吉林吉林 132001）

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種人畜共患的病原菌。它在自然界中廣泛分布，包括人、豬、牛等哺乳動(dòng)物，禽類的排泄物，蝸牛等冷血?jiǎng)游?，昆蟲，未處理的冷水，污水，肉，乳制品，蛋制品，水產(chǎn)品和冰激凌。所致疾病主要有胃腸炎型和腸道外型。我科應(yīng)用PCR方法檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，及時(shí)發(fā)現(xiàn)患者和帶菌者，為流行病學(xué)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，及時(shí)控制傳染源，為預(yù)防疾病起重要作用。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；PCR檢測(cè)方法；病原菌

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌所致疾病在世界上廣泛分布，但多集中在寒冷地區(qū)，在我國(guó)東北地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌各血清型的分布亦較廣泛。本菌可感染人類以及多種動(dòng)物，包括家畜、獸類、禽類、鳥類和昆蟲，并通過排泄物和污染的水、食品傳播。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試劑

干燥培養(yǎng)基（北京陸橋生物技術(shù)有限公司）；生物梅里埃API20E生化條；診斷血清。

1.2 儀器

美國(guó)BIO-PCR儀；Thermo生物安全柜；離心機(jī)。

1.3 樣品采集

采集急性期、用藥前采集患者新鮮糞便標(biāo)本8例，每份2～5 g，放入Cary-Blair半固體保存培養(yǎng)基中，4℃冷藏運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.4 操作

1.4.1 增菌

取1 g糞便接種于10 ml改良PBS培養(yǎng)基上，置于4℃冷增菌10～20 d。在冷增菌的第7、14、21天劃線接種于耶爾森選擇性平板、麥康凱平板，25℃培養(yǎng)24 h。增菌管內(nèi)液體量較大，在接種前應(yīng)輕輕混勻，再用接種環(huán)挑取液體，接種于預(yù)先準(zhǔn)備好的上述平板，采取分區(qū)劃線的方式，一般劃3～4區(qū)，目的是劃出單個(gè)菌落。由于總體菌量一般不大，每區(qū)劃完后可不必?zé)平臃N環(huán)，直接劃下一區(qū)即可。

1.4.2 培養(yǎng)

直接取糞便標(biāo)本接種選擇性平板（耶爾森選擇性平板、麥康凱平板），25℃培養(yǎng) 24 h。

1.4.3 鑒定

1.4.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在耶爾森選擇性培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)24 h，形成較小的濕潤(rùn)菌落，直徑為1～2 mm。中心呈深玫瑰紅色，凸起較尖銳，周圍有明顯的透明環(huán)，稱“公牛眼”。麥康凱平板25℃培養(yǎng)24 h，形成直徑為0.5～1.0 mm的小菌落，菌落為圓形、光滑、濕潤(rùn)、扁平略有凸起、半透明，中央有極淡的粉色[1]。

1.4.3.2 生化鑒定 從選擇性培養(yǎng)基上挑取5個(gè)可疑菌落進(jìn)行生化鑒定。

改良克氏雙糖試驗(yàn)：挑取可疑菌落接種于改良克氏雙糖斜面（用甘露醇取代乳糖），25℃培養(yǎng) 24～48 h[2]。挑選斜邊、底層均變?yōu)辄S色（A/A）、不產(chǎn)H2S、不產(chǎn)氣的菌株進(jìn)一步鑒定。

尿素酶試驗(yàn)和動(dòng)力觀察：將改良克氏雙糖上的可疑培養(yǎng)物接種到尿素培養(yǎng)基上，注意接種量要大，挑取一接種環(huán)，振搖數(shù)分鐘，25℃培養(yǎng)2～4 h。然后將陽(yáng)性者接種2管半固體，分別置于25℃和37℃溫箱培養(yǎng)24 h，在25℃有動(dòng)力者，進(jìn)行鏡檢和進(jìn)一步生化試驗(yàn)。

系統(tǒng)生化鑒定：可挑取上述可疑的菌落直接用API20E生化條進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定，確定菌株種屬。見表1。

表1菌株種屬生化鑒別

血清學(xué)鑒定：使用致病性菌株常見血清型（我國(guó)一般為O∶3、O∶8、O∶9 型）的特異性單克隆抗體進(jìn)行玻片凝集，從而進(jìn)行進(jìn)一步鑒定和血清分型[3-4]。

PCR鑒定：毒力基因擴(kuò)增，主要進(jìn)行以下5個(gè)基因的PCR檢測(cè)。

A.染色體源毒力基因

A1 ail：是黏附侵襲位點(diǎn)基因，介導(dǎo)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的侵襲性。

A2 ystA：是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌耐熱性腸毒素A基因，編碼致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分泌的一種耐熱腸毒素，是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌致瀉的主要原因。

A3 ystB（主要為生物1A型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌攜帶的）：編碼一種性質(zhì)類似于ystA的耐熱性腸毒素，ystB僅存在于生物1A型的菌株，而且在這個(gè)生物型中，目前證實(shí)這類菌株通常是非致病性菌株。研究報(bào)道此類菌株在腹瀉患者中能夠分離到。因此，這類菌株能否引起一些輕微的疾病有待進(jìn)一步研究，它是否能夠作為毒力決定因子，有待進(jìn)一步研究。

B.質(zhì)粒（pYV）源毒力基因

B1 yadA：黏附素，涉及自凝、血清抗性和黏附。

B2 virF：yop調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)錄活化因子，yops調(diào)節(jié)蛋白，是致病所必須的。

C.其他有關(guān)基因的擴(kuò)增

rfbC：該基因定位于rfb基因簇，O∶3血清型菌株特異性脂多糖O-側(cè)鏈的生物合成。

D.PCR擴(kuò)增程序

D1 DNA模板制備：一般檢測(cè)使用水煮模板即可（如果進(jìn)行分子生物學(xué)研究，可以使用試劑盒提取全基因組DNA，但成本較高），挑取平板上適量菌苔（200 μl槍頭尖大?。?，懸濁于 100 μl超純水，-80℃或液氮速凍 30 min（-20℃冰凍延長(zhǎng)時(shí)間也可）后迅速沸水浴 20～30 min，12 000 r/min 離心 5 min，取上清液用作模板。

D2引物序列及擴(kuò)增條件見表2。

表2 毒力基因PCR擴(kuò)增引物序列

D3擴(kuò)增體系：采用20.0 μl PCR擴(kuò)增體系，主要試劑濃度為：dNTP40mmol/μl，MgCl22.5mmol/L，引物各 1.0 μl （0.5 OD引物干粉+134 μl水），濃度為 20 μmol/L 左右；Taq 酶 5 U/μl。 見表3。

10×buffer分別含有Mg2+與不含Mg2+兩種。含有Mg2+的10×buffer使用更方便，并且含有Mg2+的10×buffer在混勻體系及分裝時(shí)不易起泡，能夠避免因泡沫造成的浪費(fèi)及體積不準(zhǔn)確。含有Mg2+的10×buffer的加入量同表3，MgCl2體積用水補(bǔ)齊。

D4擴(kuò)增及電泳：擴(kuò)增參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 15 s，退火 30 s（退火溫度見表 2），72℃延伸 30 s，25 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

表3 PCR擴(kuò)增體系

注意：同樣由于耐熱DNA酶，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)盡快電泳。如果需要過夜，則要加入適量EDTA，并且置于-20℃保存。

2 結(jié)果

O∶3血清型菌株rfbC擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性（rfbC+）。典型的致病性菌株的毒力基因的分布為 ail+、ystA+、yadA+、virF+、ystB-。傳統(tǒng)意義上的致病性菌株不攜帶ystB，非致病性菌株不攜帶 ail、ystA、yadA、virF。

生化反應(yīng)是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌鑒定的主要依據(jù)，同時(shí)還可作為生物分型的依據(jù)。生物分型在臨床上有重要意義。由于生物1A型（用水楊苷和七葉苷的陽(yáng)性反應(yīng)來(lái)確定該生物型）絕大多數(shù)是非致病性菌株，所以分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌之后，應(yīng)進(jìn)一步做生物分型。另外，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的致病血清型分別與生物1B、2、3、4和5型有密切關(guān)聯(lián)。常用的生物分型方法見表4。

3 討論

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌能產(chǎn)生一種耐熱DNA酶，水煮不能使其失活。因此，水煮模板應(yīng)盡快使用（一般不要超過1周；如果是擴(kuò)增ystA等小片段，最好使用新鮮制備的模板，可信度較高），-20℃保存，并且避免反復(fù)凍融。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在普通平板或斜面上可以存活2周以上。在0.4%腦心浸液半固體培養(yǎng)基上至少可以保存1年以上，可以作為短期保存或運(yùn)輸。長(zhǎng)期保存菌株使用15%～20%甘油肉湯（本實(shí)驗(yàn)室采用20%甘油-腦心浸液培養(yǎng)基）凍存。將大量菌苔充分懸濁于凍存液中，-80℃凍存，可保存數(shù)十年。接種菌量大有利于菌種的保存。長(zhǎng)期保存菌種的最佳方法是進(jìn)行凍干，將菌液懸濁于5%脫脂牛奶中，凍干后抽真空封口，室溫即可長(zhǎng)期保存。

按照《人間傳染的病原微生物名錄》，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌屬于第三類病原微生物，實(shí)驗(yàn)活動(dòng)應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，并采取相應(yīng)的個(gè)人防護(hù)。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌對(duì)外環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，但對(duì)常用消毒劑及各種物理消毒方法均敏感，污染的臺(tái)面、地面可用1 000～2 000 mg/L有效氯的含氯消毒劑擦拭，檢測(cè)過程中使用的標(biāo)本、用具和其他所有潛在的污染物應(yīng)當(dāng)作為具有傳染性的物質(zhì)進(jìn)行消毒處理，121℃，30 min高壓滅菌。操作人員需經(jīng)過培訓(xùn)，并通過生物安全考核和實(shí)驗(yàn)室考核方可上崗。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS271-2007)[S].2007:15.

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部、中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T4789.8-2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)[M].北京:標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009:3.

[3]齊小秋.病原生物學(xué)檢驗(yàn)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:327.

[4]何曉青.衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗(yàn)[M].北京:新華出版社,1989:330.

R37

A

1673-7210（2010）02（b）-023－03

2009-10-28）