幾種新型抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜蛋白抗凍效果研究

周愛(ài)梅，龔 翠，曹 環(huán)，郭偉杰，劉 欣，陳永泉

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

幾種新型抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜蛋白抗凍效果研究

周愛(ài)梅，龔 翠，曹 環(huán)，郭偉杰，劉 欣，陳永泉

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

以鹽溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、總巰基含量、二硫鍵、表面疏水性、凝膠強(qiáng)度為指標(biāo)，研究了海藻糖、聚葡萄糖、乳酸鈉在8%（w/w）水平上對(duì)鯪魚魚糜蛋白在-18℃凍藏26周后的抗凍效果，并將其抗凍效果與傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑（4%蔗糖+4%山梨糖醇）進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果表明：海藻糖、聚葡萄糖、乳酸鈉的加入均能較好地抑制凍藏鯪魚魚糜蛋白的冷凍變性，且乳酸鈉具有比傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑更好的抗凍效果，表現(xiàn)在它比傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑更好地抑制鯪魚魚糜鹽溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、巰基含量和凝膠強(qiáng)度的下降以及防止魚糜蛋白表面疏水性及二硫鍵的增加；海藻糖的抗凍效果也優(yōu)于傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑，其抑制二硫鍵的增加及維持魚糜鹽溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、巰基含量和凝膠強(qiáng)度的能力均強(qiáng)于商業(yè)抗凍劑；聚葡萄糖的抗凍效果與商業(yè)抗凍劑相當(dāng)，其在抑制鯪魚魚糜鹽溶性蛋白含量、巰基含量、凝膠強(qiáng)度的下降及二硫鍵、表面水性的增加方面的能力均與傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑相當(dāng)。因此，上述三種物質(zhì)可作為低甜度、低熱值的抗凍劑用于魚糜加工業(yè)，以代替高甜度、高熱值的傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑。

鯪魚魚糜，海藻糖，聚葡萄糖，乳酸鈉抗凍效果

鯪魚（Darce）主產(chǎn)于我國(guó)華南和西南水系中，是集良藥與美食于一身的魚類，其品味相當(dāng)高雅，專家認(rèn)為它“纖維多而幼，水分少而鮮，肉色白而嫩”，且鯪魚具有生長(zhǎng)快、養(yǎng)殖成本低、產(chǎn)量大的特點(diǎn)，但其缺點(diǎn)是個(gè)體小、細(xì)骨多，正常食用不方便，因此，將鯪魚加工成魚糜及魚糜制品，是提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和附加值的有效途徑之一。魚糜主要以冷凍魚糜的形式出現(xiàn)，冷凍魚糜是一種濃縮的高肌原纖維蛋白，經(jīng)采肉、漂洗、脫水、加抗凍劑制得的糜狀魚肉。添加抗凍劑能防止魚糜在冷凍過(guò)程中蛋白發(fā)生變性，并提高冷凍魚糜的凝膠強(qiáng)度，目前工業(yè)上冷凍魚糜主要采用的抗凍劑為4%蔗糖和4%山梨糖醇的混合物（稱“商業(yè)抗凍劑”），這種復(fù)合抗凍劑雖然對(duì)魚糜蛋白具有很好的抗凍效果，但甜度和熱量較高，不符合“低甜、低熱”的消費(fèi)趨勢(shì)，因而有必要研究開(kāi)發(fā)新型低甜度、低熱量抗凍劑。在國(guó)外，寡聚糖、乳糖醇以及麥芽糊精等［1-4］的抗凍效果已得到較為廣泛的研究，而在國(guó)內(nèi)對(duì)新型魚糜抗凍劑的研究不多。海藻糖、聚葡萄糖和乳酸鈉是多用途的食品添加劑，具有低熱量、低甜度的特點(diǎn)，將它們作為抗凍劑應(yīng)用于魚糜之中的研究很少。為此，本文以海藻糖、聚葡萄糖和乳酸鈉為抗凍劑，將其加入到鯪魚魚糜中，研究了這幾種抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜的抗凍效果，并將其抗凍效果與商業(yè)抗凍劑進(jìn)行比較，為開(kāi)發(fā)新型“低甜度、低熱量”的魚糜抗凍劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鯪魚魚糜 由廣東省南海食品進(jìn)出口有限公司西樵食品廠提供；海藻糖（純度≥98%） 購(gòu)于廣西南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司；乳酸鈉（濃度75%） 購(gòu)于成都聯(lián)合化工試劑研究所；聚葡萄糖（純度≥94%） 購(gòu)于廣州展晨公司；液體山梨糖醇（食品級(jí)） 購(gòu)于廣州合誠(chéng)化學(xué)有限公司；蔗糖等其它試劑 均為市售分析純或生化級(jí)試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 將鯪魚魚糜均分成5份，一份不添加任何抗凍劑，作為對(duì)照樣魚糜，另4份分別加入8%海藻糖、8%聚葡萄糖、8%乳酸鈉和8%商業(yè)抗凍劑。然后將上述5份魚糜樣品置于-18℃下貯藏26周，定期取樣測(cè)定魚糜的各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 肌動(dòng)球蛋白的提取 按文獻(xiàn)［5］的方法，稱取一定量的魚糜，加入 10倍體積的冷 KCl溶液（0.6mol/L，pH7.0），低溫均質(zhì)后離心，收集清液并加入3倍體積的冷蒸餾水，離心后收集沉淀，然后加入適量冷KCl溶液（0.6mol/L，pH7.0）溶解沉淀，離心收集上清液即為肌動(dòng)球蛋白溶液。

1.2.3 鹽溶性蛋白測(cè)定 按文獻(xiàn)［6］的方法，高離子磷酸鹽緩沖液中蛋白質(zhì)含量減去低離子磷酸鹽緩沖液中蛋白質(zhì)含量即為鹽溶性蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 Ca2+-ATPase活性的測(cè)定 按文獻(xiàn)［5］的方法，肌動(dòng)球蛋白的Ca2+-ATPase活性以每毫克蛋白質(zhì)在每分鐘內(nèi)生成的磷（Pi）的微摩爾數(shù)來(lái)表示，其單位為μmol Pi/（mg·min）。無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定采用鉬酸銨法測(cè)定［7］。

1.2.5 總巰基含量測(cè)定 按文獻(xiàn)［5］的方法，其中測(cè)定波長(zhǎng)為412nm，分子吸光系數(shù)取13600L/mol·cm，巰基含量以mol/105g蛋白計(jì)。

1.2.6 二硫鍵含量的測(cè)定 按文獻(xiàn)［5］的方法，取0.1mL濃度為4mg/mL的肌動(dòng)球蛋白溶液，加3mL的NTSB，混勻后在常溫暗處放置25min，然后在412nm測(cè)吸光值。同時(shí)做一空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 表面疏水性的測(cè)定 按文獻(xiàn)［5］的方法，以1-苯奈氨-8磺酸（ANS）作為熒光探針，測(cè)定不同濃度肌動(dòng)球蛋白在激發(fā)波長(zhǎng)374nm、發(fā)射波長(zhǎng)485nm條件下的熒光強(qiáng)度。表面疏水性以熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度對(duì)應(yīng)的曲線的斜率來(lái)表示。

1.2.8 魚糜凝膠的制作 參考文獻(xiàn)［8］的方法，魚糜水分含量調(diào)至85%，采用二段加熱法（40℃/30min和90℃/20min）加熱后制成魚糜凝膠。

1.2.9 魚糜凝膠強(qiáng)度的測(cè)定 按文獻(xiàn)［5］的方法，采用TA-XT2I/25質(zhì)構(gòu)儀先測(cè)定凝膠破斷強(qiáng)度和凹陷深度，兩者之積即凝膠強(qiáng)度（g·cm）（檢測(cè)條件：圓柱壓頭直徑5mm，壓速1.3mm/s，施加重量為5kg）。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜鹽溶性蛋白含量的影響

肌原纖維蛋白是鹽溶性蛋白，在凍藏過(guò)程中，由于變性形成分子間氫鍵、疏水鍵、二硫鍵及鹽鍵等，會(huì)導(dǎo)致其鹽溶性下降［9］。由圖1可見(jiàn)，所有樣品鹽溶性蛋白含量隨凍藏時(shí)間的增加不斷下降，對(duì)照樣下降趨勢(shì)最明顯。凍藏26周后，對(duì)照樣及添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸鈉、商業(yè)抗凍劑的樣品鹽溶性蛋白含量依次為19.6、53.3、52.5、53.9、53.3mg/g；對(duì)照樣的鹽溶性蛋白下降了80.5%，顯著高于添加抗凍劑的樣品（p＜0.05），而添加了抗凍劑的樣品間鹽溶性蛋白下降幅度差別較?。╬＞0.05），約下降了47.8%?？梢?jiàn)從鹽溶性蛋白含量來(lái)看，三種新型抗凍劑具有與商業(yè)抗凍劑相當(dāng)?shù)目箖鲂Ч?/p>

圖1 抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜在-18℃凍藏中鹽溶性蛋白含量的影響

2.2 抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

Ca2+-ATPase活性是反映魚糜肌球蛋白或肌動(dòng)球蛋白中肌球蛋白部分結(jié)構(gòu)完整性的重要指標(biāo)，凍藏過(guò)程中肌球蛋白尤其是肌球蛋白頭部的變性，會(huì)導(dǎo)致Ca2+-ATPase活性下降。圖2表明，對(duì)照樣凍藏0～12周，Ca2+-ATPase活性下降幅度為94.5%，到26周時(shí)活性僅為0.00067μmol Pi/（mg·min）；而加入抗凍劑的樣品Ca2+-ATPase活性雖然整體上也呈下降趨勢(shì)，但下降幅度比對(duì)照平緩很多，26周時(shí)添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸鈉和商業(yè)抗凍劑的樣品Ca2+-ATPase活性分別為 0.087、0.081、0.084、0.080μmol Pi/（mg·min），顯著高于對(duì)照樣（p＜0.05）；下降幅度依次為44.8%、47.7%、42.8%、45.9%，顯著低于對(duì)照樣（p＜0.05）?？梢?jiàn)抗凍劑的添加能夠防止魚糜Ca2+-ATPase活性大幅下降，從而抑制魚糜蛋白冷凍變性，其中海藻糖和乳酸鈉抗凍效果比商業(yè)抗凍劑好，聚葡萄糖的抗凍效果略差于商業(yè)抗凍劑。

圖2 抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜在-18℃凍藏中Ca2+-APTase活性的影響

2.3 抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜蛋白總巰基和二硫鍵含量的影響

由圖3可見(jiàn)，隨著凍藏時(shí)間的增加，所有樣品的巰基含量整體上都呈下降趨勢(shì)，以對(duì)照樣的下降程度最大；凍藏26周后，對(duì)照樣及添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸鈉和商業(yè)抗凍劑的樣品巰基含量分別為1.54、2.38、2.31、2.37、2.34mol/105g蛋白，以對(duì)照樣含量最低（p＜0.05），而添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸鈉的樣品與商業(yè)抗凍劑樣品之間差別不顯著（p＞0.05）。

圖3 抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜在-18℃凍藏中巰基含量的影響

圖4表明，在凍藏過(guò)程中，所有樣品的二硫鍵含量不斷增加，在凍藏過(guò)程中魚糜肌動(dòng)球蛋白不斷有二硫鍵形成。其中對(duì)照樣二硫鍵含量增加最多，26周時(shí)，對(duì)照樣及添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸鈉和商業(yè)抗凍劑的樣品二硫鍵含量分別為：3.72、2.61、2.73、2.67、2.75 mol/106g蛋白，對(duì)照樣顯著高于添加抗凍劑的樣品（p＜0.05）；二硫鍵增幅分別為176.6%、100.92%、110.62%、104.12%、110.07%，海藻糖、乳酸鈉樣品的下降幅度明顯低于商業(yè)抗凍劑樣品（p＜0.05），而聚葡萄糖和商業(yè)抗凍劑樣品差別不明顯（p＞0.05）。

圖4 抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜在-18℃凍藏過(guò)程中二硫鍵含量的影響

二硫鍵含量的增加與巰基含量的下降之間存在一定相關(guān)性，在凍藏過(guò)程中肌球蛋白分子的變性尤其是結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致了一些活性巰基的暴露，這些暴露的活性巰基發(fā)生氧化引起二硫鍵含量增加［10］。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，加入抗凍劑可以有效防止巰基的氧化，進(jìn)而抑制二硫鍵的生成，起到保護(hù)巰基、防止蛋白質(zhì)變性的作用，其中海藻糖、乳酸鈉的抑制效果比商業(yè)抗凍劑好，聚葡萄糖的抑制效果和商業(yè)抗凍劑相當(dāng)。

2.4 抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜蛋白表面疏水性的影響

新鮮魚糜蛋白的疏水性氨基酸殘基一般位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，具有較低的表面疏水性，而在凍藏過(guò)程中，蛋白質(zhì)可因變性而發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)化，使原先位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性增加［11］。圖5表明，在凍藏的0～26周，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照樣品肌動(dòng)球蛋白的表面疏水性呈明顯的上升趨勢(shì)，而添加抗凍劑的樣品表面疏水性雖在凍藏過(guò)程中也呈上升趨勢(shì)，但比對(duì)照樣上升緩慢。26周時(shí)，對(duì)照樣及添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸鈉、商業(yè)抗凍劑的樣品表面疏水性分別為90.4、78.7、81.3、83.1、81.0，上升率依次是 47.8%、32.8%、37.9%、40.9%、37.0%，其中對(duì)照樣表面疏水性及其增幅顯著高于添加抗凍劑的樣品（p＜0.05），而乳酸鈉、海藻糖與商業(yè)抗凍劑區(qū)別顯著（p＜0.05），聚葡萄糖與商業(yè)抗凍劑區(qū)別不顯著（p＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，添加抗凍劑能防止魚糜蛋白質(zhì)變性，保護(hù)蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水性氨基酸殘基。從抑制魚糜蛋白表面疏水性增加來(lái)看，海藻糖的抗凍效果強(qiáng)于商業(yè)抗凍劑，聚葡萄糖的抗凍效果和商業(yè)抗凍劑相當(dāng)，乳酸鈉的抗凍效果稍遜于商業(yè)抗凍劑。

圖5 抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜在-18℃凍藏中表面疏水性的影響

2.5 抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜蛋白凝膠強(qiáng)度的影響

凝膠能力是反映魚糜蛋白冷凍變性的最直觀的指標(biāo)。圖6表明，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，所有樣品的凝膠強(qiáng)度均有所下降，對(duì)照樣相對(duì)添加抗凍劑的樣品，凝膠強(qiáng)度下降更顯著（p＜0.05）。凍藏26周后，對(duì)照樣的凝膠強(qiáng)度只有280.20g·cm，比新鮮魚糜下降了61.6%，而添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸鈉、商業(yè)抗凍劑的魚糜凝膠強(qiáng)度分別為 486.94、477.04、415.82、411.33g·cm，海藻糖、聚葡萄糖樣品明顯高于商業(yè)抗凍劑樣品（p＜0.05），而乳酸鈉和商業(yè)抗凍劑樣品差別不顯著（p＞0.05）；四種樣品凝膠強(qiáng)度下降幅度依次為35.69%、37.78%、44.02%、45.52%，其中海藻糖、聚葡萄糖樣品和商業(yè)抗凍劑樣品有顯著差別（p＜0.05），而乳酸鈉和商業(yè)抗凍劑樣品差別不顯著（p＞0.05）?？梢?jiàn)，從凝膠強(qiáng)度來(lái)看，海藻糖、聚葡萄糖對(duì)鯪魚魚糜的抗凍效果均強(qiáng)于商業(yè)抗凍劑，而乳酸鈉的抗凍效果和商業(yè)抗凍劑相當(dāng)。

圖6 抗凍劑對(duì)鯪魚魚糜在-18℃凍藏過(guò)程中凝膠強(qiáng)度的影響

3 結(jié)論

海藻糖、乳酸鈉、聚葡萄糖對(duì)在-18℃凍藏的鯪魚魚糜蛋白的冷凍變性具有較好的抑制作用，其中乳酸鈉的抗凍效果與傳統(tǒng)的商業(yè)抗凍劑相比具有一定的優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)在它比商業(yè)抗凍劑更好地抑制鯪魚魚糜鹽溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、巰基含量和凝膠強(qiáng)度的下降，并防止魚糜蛋白表面疏水性及二硫鍵的增加；海藻糖的抗凍效果也優(yōu)于傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑，其抑制二硫鍵的增加及維持魚糜鹽溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、巰基含量和凝膠強(qiáng)度的能力均強(qiáng)于商業(yè)抗凍劑；聚葡萄糖的抗凍效果與商業(yè)抗凍劑相當(dāng)，其在抑制鯪魚魚糜鹽溶性蛋白含量、巰基含量、凝膠強(qiáng)度的下降及二硫鍵、表面疏水性的增加方面的能力均與傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑相當(dāng)。

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Study on cryoprotective effects of some new cryoprotectants on darce surimi during frozen storage

ZHOU Ai-mei，GONG Cui，CAO Huan，GUO Wei-jie，LIU Xin，CHEN Yong-quan
（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The cryoprotective effects of trehalose，polydextrose，and sodium lactate at level of 8%（w/w）in darce surimi were studied in comparison with a conventional cryoprotectan（t4%sucrose+4%sorbitol）during extended storage at-18℃ for up to 26 weeks using salt extractable protein（SEP），Ca2+-ATPase activity，total sulfhydryl content，disulfide bond content，surface hydrophobicity and gel strength as indicators.The results indicated that the addition of trehalose，polydextrose and sodium lactate could all retard the protein denaturation of frozen darce surimi and the cryoprotective effect of sodium lactate was superior to that of commercial cryoprotectant as evidenced by lowered decrease in SEP，Ca2+-ATPase activity，total sulfhydryl content and gel-forming ability as well as the impeded increase in surface hydrophobicity and disulfide bond content.Also，the cryoprotective effect of trehalose was better than that of commercial cryoprotectant as indicated by its better ability of inhibiting the increase of disulfide bond and its better ability of maintaining SEP，Ca2+-ATPase activity，total sulfhydryl content and gel-strength.The cryoprotective effect of polydextrose was comparable to that of commercial cryoprotectant as shown by its comparable ability of retarding the decrease of SEP，total sulfhydryl content and gel-strength and its comparable ability of inhibiting the increase of disulfide bond and surface hydrophobicity.Therefore，owing to their low sweetness and calorie，the above three substances appeared to be promising alternative cryoprotectants of the conventional cryoprotectant with high sweetness and calorie in surimi industry.

darce surimi；trehalose；polydextrose；sodium lactate；cryoprotective effects

TS254.4

A

1002-0306（2010）10-0318-04

2009-09-25

周愛(ài)梅（1971-），女，博士，副教授，主要從事食品化學(xué)及水產(chǎn)品加工研究。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2003C50203）。