大葉藻中黃酮類物質(zhì)提取工藝的研究

黃媛媛，張朝輝，李八方，趙 雪

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

大葉藻中黃酮類物質(zhì)提取工藝的研究

黃媛媛，張朝輝，李八方，趙 雪

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

研究了大葉藻中黃酮的乙醇提取工藝，以大葉藻中黃酮提取率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)，考察提取溫度、乙醇濃度、固液比、提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果確定最佳提取工藝條件為：提取溫度55℃，提取固液比1∶30，提取溶劑乙醇濃度85%，提取時(shí)間3h。在最佳提取條件下，提取率可高達(dá)1.80%。

大葉藻，黃酮，乙醇，正交實(shí)驗(yàn)

海草是一類生活在溫帶海域沿岸淺水中的單子葉草本植物。海草有發(fā)育良好的根狀莖（水平方向的莖），葉片柔軟、呈帶狀。目前中國(guó)記錄有14種海草，如喜鹽草、大葉藻等。大葉藻（Zostera marina L.），隸屬于眼子菜科大葉藻屬（Zostera L.），分布于我國(guó)河北和山東等沿海地區(qū)，朝鮮、日本、俄羅斯等地也有分布。大葉藻的葉子細(xì)長(zhǎng)呈帶狀，長(zhǎng)30～150cm，寬0.7～1.5cm，呈鮮艷綠色，春夏兩季生長(zhǎng)繁茂。黃酮類化合物是泛指具有兩個(gè)酚羥基的苯環(huán)（A -與B-環(huán)）通過(guò)中央三碳原子相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物［1］。黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗突變、抗衰老、抗腫瘤、抗菌等，是茶及眾多中草藥如黃芩、銀杏、沙棘等的活性成分。黃酮可以改善血液循環(huán)，降低膽固醇，向天果中的黃酮還含有一種PAF抗凝因子，這些作用大大降低了心腦血管疾病的發(fā)病率，改善心腦血管疾病的癥狀。黃酮類化合物具有抗氧化活性，主要表現(xiàn)在減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基兩個(gè)方面［2］，是延緩衰老的重要活性物質(zhì)。目前國(guó)內(nèi)尚未有從海草——大葉藻中提取黃酮類物質(zhì)的研究報(bào)道，本研究的目的是從大葉藻中提取黃酮化合物，為進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大葉藻 采于青島棧橋附近，低溫烘干后用搗碎機(jī)粉碎制成粉末；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)于南京替斯艾么中藥研究所；乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純。

FW100搗碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；A1204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2102PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 龍尼柯（上海）儀器有限公司；量筒，容量瓶，剪刀等。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［3］

準(zhǔn)確稱取10mg標(biāo)準(zhǔn)蘆丁對(duì)照品，以95%乙醇溶液定容至50mL，搖勻即得濃度為0.2mg/mL標(biāo)樣儲(chǔ)備液，準(zhǔn)確移取0.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL蘆丁標(biāo)樣儲(chǔ)備液于6個(gè)25mL容量瓶中，分別加入0.3mL濃度為5%的NaNO2溶液，搖勻后靜置6min，加入0.3mL濃度為10%的Al（NO3）3溶液，搖勻后靜置6min，再加入2mL濃度為4%的NaOH溶液，搖勻，用95%乙醇定容至刻度，搖勻后靜置15min。以95%乙醇為空白，用1cm比色皿，在400～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)，然后在最大吸收波長(zhǎng)處分別測(cè)定不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度。以吸光度Y對(duì)濃度X進(jìn)行回歸。計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3 大葉藻中黃酮類物質(zhì)提取的單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響 在提取溫度為室溫20℃的條件下，選取料液比為1∶20，提取2h，做提取溶劑乙醇濃度的單因素實(shí)驗(yàn)。選取乙醇濃度為45%、55%、65%、75%、85%、95%。

1.3.2 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響 在乙醇濃度為55%的條件下，選取料液比為1∶20，溫度為20℃，做提取時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)，選擇時(shí)間為1、2、3、4、5、6h。

1.3.3 料液比對(duì)黃酮提取率的影響 在提取溫度20℃、乙醇濃度55%、提取時(shí)間2h，做料液比的單因素實(shí)驗(yàn)，料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40。

1.3.4 溫度對(duì)黃酮提取率的影響 在提取時(shí)間2h、乙醇濃度55%、料液比為1∶20的條件下，做提取溫度的單因素實(shí)驗(yàn)。選擇溫度為 25、35、45、55、65、75℃。

1.3.5 黃酮提取率計(jì)算

式中：黃酮濃度，mg/mL；溶液體積，mL；原料質(zhì)量，mg。

1.4 大葉藻中黃酮提取的正交實(shí)驗(yàn)

在以上的單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比為因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，以確定大葉藻中黃酮的最佳提取工藝條件，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在400～600nm內(nèi)測(cè)得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)為500nm，在此波長(zhǎng)下得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響 從圖2可以看出，隨著乙醇濃度的升高，黃酮提取率上升，乙醇濃度達(dá)到75%左右時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值，而后隨著乙醇濃度的增加黃酮提取率下降，這說(shuō)明75%乙醇濃度是提取黃酮的最佳乙醇濃度。造成這種現(xiàn)象的主要原因是乙醇濃度不同，極性也不相同，75%乙醇的極性與大葉藻中黃酮的極性相似［4］，隨著乙醇濃度的升高，一些脂溶性物質(zhì)的溶出增加，影響了黃酮的浸出。

圖2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響 從圖3可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮的提取率先上升后下降，在3h時(shí)達(dá)到最大值。原因是時(shí)間過(guò)短，黃酮物質(zhì)還未充分溶出，時(shí)間在3h時(shí)，黃酮溶出已達(dá)平衡，再延長(zhǎng)提取時(shí)間，一些熱敏性組分被破壞或提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)乙醇揮發(fā)導(dǎo)致濃度下降而使提取率下降。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

2.2.3 料液比對(duì)黃酮提取率的影響 從圖4可以看出，隨著料液比的增加，黃酮提取率在不斷上升，但是隨著料液比的增加，后續(xù)分離提純的難度也越來(lái)越大，因此，在所做單因素實(shí)驗(yàn)中，料液比的最大值選擇1∶40。

圖4 提取料液比對(duì)黃酮提取率的影響

2.2.4 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響 從圖5可以看出，隨著溫度的升高，黃酮提取率在不斷上升，在所選取的溫度范圍內(nèi)，最高溫度75℃，總黃酮的提取率達(dá)到最大。由于黃酮對(duì)溫度的不穩(wěn)定性，較高溫度會(huì)對(duì)黃酮造成一定量的分解或是影響其活性，所以選取溫度75℃為本實(shí)驗(yàn)黃酮的提取溫度［5］。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

從表2的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，大葉藻中黃酮的最佳提取工藝條件為：提取溶劑乙醇濃度為85%，提取時(shí)間3h，提取料液比為1∶30，提取溫度55℃，在此條件下，提取率最高。各種因素對(duì)提取效果影響的主次順序?yàn)椋禾崛r(shí)間＞提取料液比＞提取溫度＞提取溶劑乙醇的濃度；通過(guò)方差分析可知，料液比對(duì)提取率影響顯著。

表3 方差分析

圖5 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響

表2 L16（45）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3 結(jié)論

本文考察了影響大葉藻黃酮乙醇提取的各因素條件，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定了大葉藻黃酮的乙醇提取最佳工藝條件為：提取溫度55℃，提取時(shí)間3h，乙醇濃度85%，料液比1∶30。在最佳提取條件下，提取率可達(dá)1.80%。將粗提取物經(jīng)過(guò)二次結(jié)晶，會(huì)得到純度極高的大葉藻黃酮制品。

［1］姚新生.天然藥物化學(xué)［M］.第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：191-195.

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Extraction technology of flavonoids from Zostera marina L.

HUANG Yuan-yuan，ZHANG Zhao-hui，LI Ba-fang，ZHAO Xue
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The flavonoids were extracted from Zostera marina L.with ethanol.The quantity proportion of flavonoids extracted from Zostera marina L.was investigated.Some factors，such as extraction temperature，ethanol concentration，the ratio of solid to liquid，extracting time were studied as the main factors on the extracting quantity.The single factor and orthogonal experiments showed that the optimum extraction conditions were as follows：extracting temperature 55℃，the ratio of solid to liquid 1∶30，ethanol concentration 85%，extracting time 3 hours.Under the best condition，the extraction rate can be as high as 1.80%.

Zostera marina L.；flavonoids；ethanol extraction；orthogonal experiment

TS201.1

B

1002-0306（2010）11-0291-03

2009-11-16

黃媛媛（1986-），女，碩士，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)。

國(guó)家自然科學(xué)基金（30771674）；教育部重點(diǎn)項(xiàng)目（109099）。