藍(lán)果忍冬總黃酮提取工藝研究

趙 佳，霍俊偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

藍(lán)果忍冬總黃酮提取工藝研究

趙 佳，霍俊偉*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

采用乙醇提取法提取藍(lán)果忍冬中總黃酮，并采用分光光度法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品測定藍(lán)果忍冬果實(shí)中總黃酮的含量。通過單因素實(shí)驗(yàn)分析了乙醇濃度、料液比、提取溫度及提取時間四個主要因素對提取液中總黃酮含量的影響。再在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化藍(lán)果忍冬果實(shí)總黃酮的提取條件。結(jié)果表明：藍(lán)果忍冬果實(shí)總黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度70%，料液比1∶50，提取溫度50℃，提取時間2.5h。此條件下總黃酮的含量為27.44mg/g。

藍(lán)果忍冬，總黃酮，提取工藝

藍(lán)果忍冬（Lonicera caerulea L.）俗稱藍(lán)靛果、黑瞎子果、山茄子、羊奶子等。在植物分類學(xué)上屬于忍冬科（Caprifoliaceae）、忍冬屬（Lonicera Linn.）、忍冬亞屬（Subgen.Lonicera）、囊管組（Sect.isika DC.）、壇果亞組（Subsect caeruleae Rehd.）［1］。藍(lán)果忍冬主要分布在我國吉林省長白山區(qū)、黑龍江省大、小興安嶺、東部山區(qū)以及內(nèi)蒙古、華北、西北、四川等地。此外，俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、日本及朝鮮北部等地都有分布［2］。藍(lán)果忍冬是一種野生漿果類植物，含有豐富的氨基酸、維生素和生物活性物質(zhì)，營養(yǎng)保健價值極高，很早就被用于民間醫(yī)療，可促進(jìn)血液循環(huán)、防治心血管疾病、降血壓、清熱解毒、抗疲勞、抗氧化，甚至具有抗腫瘤的功效，因此，在醫(yī)學(xué)上具有一定價值［3-5］。除此之外，藍(lán)果忍冬果實(shí)還適合鮮食以及加工成果汁、果酒、飲料、果醬、罐頭等，也是加工天然食用色素的原料［6］。藍(lán)果忍冬果實(shí)中所含的黃酮類化合物作為一種功能成分，具有許多有益的生理功能和藥理作用，越來越引起人們的重視。目前對黃酮類成分定量及定性分析已有文獻(xiàn)報道，但以藍(lán)果為實(shí)驗(yàn)材料的研究還較少［7-9］。本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法測定藍(lán)果忍冬果實(shí)中黃酮類化合物的含量，對其最佳提取工藝進(jìn)行初步研究，為藍(lán)果忍冬藥用價值、經(jīng)濟(jì)價值的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)果忍冬果實(shí) 2009年5月采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝中心；蘆?。╮utin）標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉 均為分析純。

T6可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；R205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 配有W2058型數(shù)控恒溫水浴鍋，上海申勝生物技術(shù)有限公司；SHBⅢA循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城工貿(mào)有限公司；BT124S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HWS28型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)果忍冬果實(shí)中總黃酮的測定

1.2.1.1 對照品溶液的制備 參照的方法［10］精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的的蘆丁對照品50mg，至25mL容量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱，溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取10mL置100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得（含無水蘆丁0.2mg/mL）。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0與6.0mL，分別置于25mL容量瓶中，各加水至 6.0mL，加 5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻，放置6min，加4%氫氧化鈉溶液10.0mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，在510nm波長處測定吸光度。

1.2.1.3 樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取1.0g藍(lán)果忍冬果，粉碎，按一定條件提取后，將提取液抽濾，取濾液濃縮，所得濾液1mL置于25mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻備用。

1.2.1.4 樣品總黃酮含量的測定 取上述樣品溶液3mL，置于25mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，以樣品溶液3mL加水稀釋至25mL作空白對照，測定吸光度。計算提取液中的總黃酮含量。

式中，C為總黃酮濃度（mg/mL）；N為稀釋倍數(shù)；V為最初定容體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 乙醇濃度對藍(lán)果忍冬果實(shí)總黃酮提取的影響 保持料液比、提取溫度及提取時間不變，分別測定乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%時藍(lán)果忍冬果實(shí)中總黃酮的含量。

1.2.2.2 料液比對藍(lán)果忍冬果實(shí)總黃酮提取的影響

保持乙醇濃度、提取溫度及提取時間不變，分別測定料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70時藍(lán)果忍冬果實(shí)中總黃酮的含量。

1.2.2.3 提取溫度對藍(lán)果忍冬果實(shí)總黃酮提取的影響 保持乙醇濃度、料液比及提取時間不變，分別測定提取溫度為30、40、50、60、70℃時藍(lán)果忍冬果實(shí)中總黃酮的含量。

1.2.2.4 提取時間對藍(lán)果忍冬果實(shí)總黃酮提取的影響 保持乙醇濃度、料液比及提取溫度不變，分別測定提取時間為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h時藍(lán)果忍冬果實(shí)中總黃酮的含量。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 參照單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對乙醇濃度、料液比、提取溫度以及提取時間四個提取條件進(jìn)行初步篩選，通過四個因素，三個水平L9（34）正交實(shí)驗(yàn)分析提取條件對藍(lán)果忍冬果實(shí)總黃酮提取的影響，優(yōu)選最佳提取工藝。L9（34）因素水平見表1。

表1 L9（34）因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（C）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，回歸方程為：y=5.2714x+ 0.0019，R2=0.9992。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對提取結(jié)果的影響 從圖2中可以看出，隨乙醇濃度的增加，吸光度先增高后降低，其中乙醇濃度為70%時吸光度最大，即提取液中總黃酮含量最多，當(dāng)乙醇濃度超過70%后，總黃酮含量開始降低。可能是由于隨著乙醇濃度增大，黃酮類化合物達(dá)到飽和，同時一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親酯性強(qiáng)的成分溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭同乙醇-水分子結(jié)合，從而導(dǎo)致黃酮類化合物的提取率下降［8］。故因此確定乙醇濃度在 70%左右較好。

圖2 乙醇濃度對總黃酮提結(jié)果的影響

2.2.2 料液比對提取結(jié)果的影響 從圖3中可以看出，最初隨著料液比的增大總黃酮含量也逐漸增大，但達(dá)到一定的料液比后，總黃酮含量開始減少，其中料液比為1∶50時總黃酮含量最高。一般來說，溶劑用量越大，提取率越大，但是過多的料液比會造成溶劑和能源的浪費(fèi)，同時增大溶劑量，很有可能把一些不易溶出的成分提取出來造成黃酮類化合物的提取率降低［9］。因此1∶50的料液比最合適。

圖3 料液比對總黃酮提結(jié)果的影響

2.2.3 提取溫度對提取結(jié)果的影響 從圖4中可知，在30～50℃期間，隨著溫度的升高，吸光度也隨之增高；在50～70℃期間，隨著溫度的升高吸光度反而降低。在初始階段，隨著提取溫度的升高黃酮類化合物的含量升高，但是溫度過高可能引起黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被氧化破壞導(dǎo)致其含量降低［10］。因此50℃為適宜提取溫度。

圖4 提取溫度對總黃酮提結(jié)果的影響

2.2.4 提取時間對提取結(jié)果的影響 從圖5中可知，隨著提取時間的增長，總黃酮的含量呈現(xiàn)先增加后下降的變化規(guī)律，當(dāng)提取時間為2.0h時，提取效果最好。但若時間繼續(xù)延長，總黃酮含量反而降低。這可能是提取時間太長，某些黃酮類化合物分解所致。因此，選擇提取時間為2.0h左右為宜。

圖5 提取時間對總黃酮提取結(jié)果的影響

2.3 總黃酮提取工藝優(yōu)化

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

由表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，影響總黃酮得率的主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即乙醇濃度＞料液比＞提取溫度＞提取時間。乙醇提取藍(lán)果忍冬果實(shí)中總黃酮的最佳的提取工藝為：A2B2C2D3，即選用70%乙醇，料液比為1∶50，在50℃的條件下提取2.5h。按A2B2C2D3組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，總黃酮得率為27.44mg/g。

3 結(jié)論

目前，對藍(lán)果忍冬果實(shí)中總黃酮提取的研究報道較少，還未見探討優(yōu)化提取條件的文章，本實(shí)驗(yàn)首次研究乙醇濃度等因素對總黃酮提取率的影響，結(jié)果表明：

3.1 通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，確定提取藍(lán)果忍冬果實(shí)總黃酮的最佳工藝為：選用70%乙醇，料液比為1∶50，在50℃的條件下提取2.5h。這時藍(lán)果忍冬果實(shí)總黃酮的含量為27.44mg/g。

3.2 在影響藍(lán)果忍冬果實(shí)中總黃酮含量的四個提取條件中，乙醇濃度影響最大，為最顯著因子，其次為料液比和提取溫度，提取時間影響最小。

［1］霍俊偉，楊國慧，睢薇，等.藍(lán)靛果忍冬（Lonicera caerulea）種質(zhì)資源研究進(jìn)展［J］.園藝學(xué)報，2005，32（1）：159-164.

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［8］侯江雁，李彥冰.藍(lán)靛果果實(shí)中總黃酮的含量測定［J］.黑龍江醫(yī)藥，2001，14（4）：252.

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［10］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.2000年版.廣州：廣東科技出版社，2000：173.

Study on extraction technology of total flavonoids from berry of blue honeysuckle（Lonicera caerulea L.）

ZHAO Jia，HUO Jun-wei*
（College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Total favonoids in berry of blue honeysuckle（Lonicera caerulea L.）was extracted by ethanol，and its content was detected by spectrometric method with rutin as standard material.ln the extracting process of total flavonoids，four main factors including concentration of extracting ethanol，solid-liquid ratio，temperature and time were studied by single factor analysis method.Based on single factor test，the optimal extraction conditions of total flavonoids were determined by orthogonal test as follows：ethanol concentration 70%，solid-liquid ratio 1∶50，temperature 50℃and extracting time 2.5h.Total flavonoids yield from blue honeysuckle（Lonicera caerulea L.）was 27.44mg/g by the optimal process.

blue honeysuckle（Lonicera caerulea L.）；total flavonoids；extraction technology

TS255.1

B

1002-0306（2010）11-0242-03

2009-12-02 *通訊聯(lián)系人

趙佳（1984-），女，在讀碩士研究生，研究方向：小漿果生物活性物質(zhì)分離、提取、鑒定。

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科技專項(xiàng)（nyhyzx07-028）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新專項(xiàng)項(xiàng)目（CXZ005-1）；黑龍江省科技攻關(guān)項(xiàng)目（GB06B112）；哈爾濱市科技攻關(guān)項(xiàng)目（2007AA6CE114）。