吊燈花提取物體外抗氧化活性評價

吳蘭芳，景永帥，張振東，楊 娟

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽550002）

吊燈花提取物體外抗氧化活性評價

吳蘭芳1，2，景永帥1，2，張振東1，2，楊 娟2，*

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽550002）

目的：評價吊燈花提取物的體外抗氧化活性。方法：以乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水為樣品提取劑，以VC作陽性對照，采用水楊酸法、二苯代苦味基肼自由基（DPPH·）法和Fe3+還原能力實驗，對吊燈花不同極性溶劑提取物的體外抗氧化能力進(jìn)行評價。結(jié)果：吊燈花各提取物均對羥基自由基有較強的清除作用，其中粗多糖的清除能力最強，半清除率濃度為0.61mg/mL，但效果不如VC明顯；各提取物對DPPH自由基有很強的清除作用，以乙酸乙酯萃取物清除能力為最強，半清除率濃度為0.13mg/mL。同時以上提取物還對Fe3+具有很強的還原能力，其中石油醚提取物的還原能力最強。結(jié)論：吊燈花具有明顯的抗氧化活性，在抗衰老方面有廣泛應(yīng)用前景。

吊燈花，抗氧化活性，自由基，還原力

吊燈花為蘿藦科（Asclepiadaceae）吊燈花屬（Ceropegia）植物［1］，又名燈籠花、假西藏紅花［2］，該屬植物約170種，分布于亞洲東南部，經(jīng)印度、馬達(dá)加斯加到非洲，中國產(chǎn)14種，四川、貴州、云南和廣西等省區(qū)有栽培［3-4］。全草或根入藥，具有清熱解毒，補虛，祛風(fēng)除濕等功效，主治勞傷虛弱，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，腳氣病等［5］。據(jù)報道，吊燈花屬植物燈心草吊燈花總生物堿成分有保肝、退熱、止痛、局部麻醉、抗?jié)?、降壓等活性，且無毒副作用；從中分離出的吊燈花素是從自然界得到的第一個呋喃駢吡啶類生物堿，具有較強的止痛作用［6-8］。除此而外，關(guān)于吊燈花屬植物的化學(xué)成分、現(xiàn)代藥理研究方面的文獻(xiàn)報道很少［9-10］。為了更好開發(fā)利用吊燈花資源，本實驗運用水楊酸法、二苯代苦味基肼自由基（DPPH·）法、Fe3+還原能力的方法對吊燈花不同極性溶劑提取物體外抗氧化活性進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

吊燈花藥材 2009年7月購自貴州省貴陽市萬東橋藥材市場，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院陳德媛教授鑒定為長葉吊燈花（Ceropegia dolichpohylla Schltr.）；二苯代苦味基肼自由基（DPPH·） 百靈威公司；VC、無水乙醇、H2O2、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸 均為國產(chǎn)分析純試劑。

HP-8453型紫外可見分光光度計 惠普公司；JA2003精密電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；DK-98-11電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的提取和制備 將干燥的長葉吊燈花根135g粉碎，加80%乙醇回流提取6次，每次2h，乙醇提取液減壓濃縮至無醇味，真空干燥后，得長葉吊燈花總醇提物。取20g醇提物用水混懸后依次用兩倍體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取6次，各萃取液及萃取后的水層部分減壓濃縮，經(jīng)真空干燥后得石油醚提取物3.8g、氯仿提取物2.1g、乙酸乙酯提取物1.9g、正丁醇提取物4.9g及水層部分4.6g，作為待測樣品置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

將乙醇浸提后的藥材殘渣在室溫下?lián)]去乙醇，加入蒸餾水，沸水浴提取6次，每次2h。合并水提液減壓濃縮至一定的體積，加入乙醇沉淀多糖，乙醇最終濃度不低于80%，沉淀依次用95%的乙醇、丙酮洗滌后，真空干燥得長葉吊燈花粗多糖11.5g，作為待測樣品置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗氧化活性測定

1.2.2.1 清除羥基自由基［11］采用 Fenton反應(yīng)，利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生羥基自由基，在該體系中加入水楊酸捕捉羥基自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm處有最大吸收。取醇提部分萃取物各50mg，用無水乙醇溶解并定容至25mL；取粗多糖50mg，用蒸餾水定容至25mL，配制得質(zhì)量濃度為2mg/mL的母液備用。加入一定濃度樣品 4mL，9mmol/L FeSO40.5mL，9mmol/L水楊酸 0.5mL，8.8mmol/L H2O20.5mL，混勻，于 37℃水浴中加熱30min，510nm測定樣品吸光度（Ai），將體系中的樣品改為加入4mL蒸餾水，測定得空白對照吸光度（A0），當(dāng)向體系中加入0.5mL蒸餾水代替8.8mmol/L H2O2時，測定得樣品本底吸光度（Aj），其中（Ai）每個質(zhì)量濃度做三個平行，取平均值，以VC作陽性對照，按公式（1）計算清除率。

1.2.2.2 清除DPPH自由基［12-13］DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，在有機溶劑中呈紫色，在517nm波長處有較大吸收，當(dāng)加入抗氧化劑，一部分自由基被清除掉，使在該波長下的吸收減弱，可借此來評價某物質(zhì)的抗氧化活性。取醇提部分萃取物各50mg，分別用無水乙醇溶解并定容至25mL；取粗多糖50mg，蒸餾水溶解并定容至25mL，配制得質(zhì)量濃度為2mg/mL各樣品，再以該質(zhì)量濃度配制成所需濃度。以無水乙醇配制0.16mmol/L DPPH溶液，置于棕色容量瓶中。取3mL樣品溶液加入3mL DPPH溶液于25℃水浴中加熱15min后，在517nm測得試樣吸光度（Ai），取3mL蒸餾水代替樣品測得空白吸光度（A0），以3mL樣品中加入3mL蒸餾水測得樣品本底吸光度（Aj），其中（Ai）每個樣品質(zhì)量濃度做三個平行，取平均值。以VC作陽性對照，按公式（2）計算清除率。

1.2.2.3 Fe3+還原力實驗測定［14］取2.5mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，加入0.2mol/L磷酸緩沖液2.5mL及1%鐵氰化鉀2.5mL，50℃水浴反應(yīng)20min后急速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5mL混勻，過濾，取上清液5mL，加入0.02%三氯化鐵溶液5mL，10min后立即于700nm處測定吸光值。吸光值越大則還原能力越強，以VC作為對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 對羥基自由基的清除作用

結(jié)果見圖1和表1。圖1顯示，各部分提取物對羥基自由基都表現(xiàn)出一定程度的清除能力，且水溶性成分對羥基自由基的清除作用強于醇溶性成分，醇提物的各萃取部分隨著極性增大而清除能力變?nèi)?，各部分的清除效果均弱于VC。在實驗選取的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除能力大小依次為：粗多糖部分＞水層部分＞總醇提取物＞石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞正丁醇提取物。

圖1 清除羥基自由基作用

表1顯示，長葉吊燈花提取物對羥基自由基清除活性的半清除率濃度（IC50）值順序為：VC＜粗多糖＜水層部分＜石油醚提取物＜乙酸乙酯提取物＜總醇提取物＜氯仿提取物＜正丁醇提取物。半清除率濃度越小則清除能力越強。除乙酸乙酯提取物外，醇提物的各提取部分的半清除率濃度隨著提取溶劑極性增大而增大。

2.2 對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基是一類較為穩(wěn)定的芳香類自由基，天然抗氧化物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力被認(rèn)為是抗氧化物質(zhì)清除自由基的總能力［15］。結(jié)果見圖2和表2。圖2顯示，長葉吊燈花水提取物和醇提取物均能清除DPPH自由基，其清除率隨反應(yīng)體系含提取物質(zhì)量的增加而加大，在質(zhì)量濃度相同的情況下，醇提取物對DPPH自由基的清除作用高于水提取物。但各部分的清除能力都低于VC，清除能力大小依次為VC＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞總醇提取物＞石油醚提取物＞正丁醇提取物＞水層＞粗多糖。

表2顯示，對DPPH清除作用的半清除率濃度（IC50）大小依次為VC＜乙酸乙酯提取物＜氯仿提取物＜總醇提取物＜石油醚提取物＜正丁醇提取物＜粗多糖＜水層部分。半清除率濃度大小與清除能力大小成負(fù)相關(guān)，即半清除率濃度越小，清除能力越大。結(jié)果表明，乙酸乙酯提取物部分清除DPPH自由基效果較好。

表1 長葉吊燈花提取物對·OH清除活性的IC50值

表2 長葉吊燈花提取物對DPPH·清除活性的IC50值

圖2 清除DPPH自由基作用

2.3 Fe3+還原力的測定

抗氧化劑的抗氧化能力與其還原力有關(guān)，還原力越大，抗氧化能力越強?？寡趸瘎┠軌蛟谝欢ǖ臈l件下將 Fe3+還原為 Fe2+，因此，根據(jù) Fe3+還原為Fe2+的多少來間接評價各種提取物的抗氧化能力。結(jié)果見圖3。圖3顯示，各提取物的還原能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。醇提物的各萃取部分隨著極性的增大，還原能力變?nèi)酢８鞑糠值倪€原能力大小依次為：VC＞石油醚提取物＞氯仿提取物＞總醇提取物＞水層部分＞粗多糖部分＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物。

圖3 對Fe3+的還原能力曲線

3 結(jié)論

自由基理論認(rèn)為衰老是氧自由基過度反應(yīng)的結(jié)果，有機體的新陳代謝速率越高，氧自由基的產(chǎn)生就越快，衰老過程就加快，清除自由基可起到延年益壽的作用［16］。在實驗所選的三種體外抗氧化評價方法中，從對兩種自由基的清除率和半清除率濃度看，長葉吊燈花各提取物對DPPH自由基的清除作用優(yōu)于羥基自由基。在同一個抗氧化評價指標(biāo)中，不同溶劑提取物的抗氧化能力存在較大差異，在羥基自由基的清除實驗中，粗多糖的清除效果最強，醇提部分的活性集中體現(xiàn)在乙酸乙酯提取物和氯仿提取物。而在DPPH·實驗中，醇溶性成分的清除能力比水溶性成分的強，尤其以乙酸乙酯提取物和氯仿提取物的清除效果為好。在鐵離子的還原能力測定實驗中，石油醚提取物對Fe3+的還原能力最強。由此可以看出，長葉吊燈花中的抗氧化活性成分除粗多糖外，主要集中在醇提物的中小極性部分。本研究為吊燈花的開發(fā)和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］張小卉，辜天琪，田先華，等.陜西省蘿藦科一新記錄屬——吊燈花屬［J］.西北植物學(xué)報，2008，28（2）：406-407.

［2］李萬方.奇特的吊燈花［J］.中國花卉盆景，2002（12）：6.

［3］蔣英，李秉滔.中國植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，1977，63：564-575.

［4］中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒［M］.第三冊.北京：科學(xué)出版社，1983：871.

［5］何順志，徐文芬.貴州中草藥資源研究［M］.貴陽：貴州科技出版社，2007：546-547.

［6］Sukumar E，Gopal H，Rao R B，et al.Pharmacological actions of cerpegin，a novel pyridine alkaloid from Ceropegia juncea［J］. Fitoterapia，1995，66（5）：403-406.

［7］Nikam T D，Savant R S.Multiple shoot regeneration and alkaloid cerpegin accumulation callus culture of Ceropegia juncea Roxb［J］.Physiol Mol Biol Plants，2009，15（1）：71-77.

［8］Adibatti N A，Thirugnanasambantham P，Kuilothungan C.A pyridine alkaloid from Ceropegia juncea［J］.Phytochem，1991，30：2449-2450.

［9］Alasbahi R，Melzig M F.Screening of some Yemeni medicinal plants for inhibitory activity against peptidases［J］.Pharmazie，2008，63（1）：86-88.

［10］Alkalemji A，Paulsen E.Allergic occupational dermatitis due to Ceropegia woodii（string of hearts）［J］.Contact Dermatitis，2007，56（6）：367-369.

［11］劉春蘭，劉海青，鄧義紅，等.沙棘葉水溶性多糖的分離純化及體外清除自由基活性研究［J］.中藥材，2006（2）：151-154.

［12］高春燕，田呈瑞，周默.枸杞多糖體外清除自由基活性研究［J］.三峽大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005（5）：456-458.

［13］柳建軍，許立松，王菁菁，等.黃連木嫩葉抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（9）：45-47.

［14］劉朝霞，胡士德，鄒坤，等.資木瓜乙醇提取物的體外抗氧化活性研究［J］.三峽大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008（4）：72-75.

［15］嚴(yán)奉偉，朱建飛，吳謀成.功能食品清除自由基活性評價方法及其進(jìn)展［J］.長江大學(xué)學(xué)報：農(nóng)學(xué)卷，2006，3（4）：214-217.

［16］徐敏.人體自由基與衰老的關(guān)系［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，5（3）：289-290.

Evaluation on antioxidant activity of Ceropegia dolichpohylla extracts in vitro

WU Lan-fang1，2，JING Yong-shuai1，2，ZHANG Zhen-dong1，2，YANG Juan2，*
（1.College of Life，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China）

Objective：To evaluate on antioxidant activities of extracts from Ceropegia dolichpohylla in vitro.Methods：Salicylic acid method，DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）method and deoxidization Fe3+were used to evaluate the antioxidant activities in vitro of samples，which extracted using ethanol，petroleum ether，chloroform，ethyl acetate，n-butanol and water from Ceropegia dolichpohylla，respectively，and VCwas used as comparison sample.Results：The extracts had good scavenging activities for hydroxyl radical（·OH），especially crude polysaccharide showed the highest activity and its half elimination ratio（lC50）was 0.61mg/mL，but the activity was weaker than that of VC.The extracts had strong scavenging activities on DPPH radical，the effect of ethyl acetate extracts was the strongest and its lC50value was 0.13mg/mL.Meanwhile，the above extracts had stronger deoxidizing Fe3+activity，the activity of the petroleum ether extracts was the strongest.Conclusion：Ceropegia dolichpohylla has stronger antioxidative activity and will be widely applicated on antiaging.

Ceropegia dolichpohylla；antioxidetive activity；free radical；deoxidization

TS201.1

A

1002-0306（2010）11-0078-03

2010-01-06 *通訊聯(lián)系人

吳蘭芳（1985-），女，碩士研究生，研究方向：藥食資源利用。

國家自然科學(xué)基金（30760297）；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2009CB526512）。