鯉魚組織蛋白酶L活性的影響因素研究

侯魯娜，陳學云，聶小華，劉 璘

（浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州310014）

鯉魚組織蛋白酶L活性的影響因素研究

侯魯娜，陳學云，聶小華*，劉 璘

（浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州310014）

主要研究了鯉魚組織蛋白酶L活性的影響因素。結果表明，鯉魚組織蛋白酶L具有較強的穩(wěn)定性，在-20℃凍藏、20～50℃加熱處理、不同酸性環(huán)境中均保留了一定程度的活性；魚肉中組織蛋白酶L在漂洗工藝中并不能完全去除，漂洗后仍殘存了45.65%活性。此外，鯉魚組織蛋白酶L在豆科類蛋白、大米蛋白、雞蛋清蛋白、馬鈴薯蛋白、茶多酚和大豆異黃酮等各種食品組分作用下，其活性發(fā)生明顯的下降，且呈現(xiàn)良好的量效關系。

鯉魚，組織蛋白酶L，影響因素

鯉魚是我國淡水養(yǎng)殖的主要品種，養(yǎng)殖面積大，產(chǎn)量高［1］；但鑒于其肉質(zhì)粗糙和土腥味，鯉魚的鮮銷受到很大程度的限制，急需進行深加工以提高其附加值。魚糜制品是一類營養(yǎng)豐富、口味多樣、實用方便的低膽固醇食品，深受消費者歡迎，是發(fā)展較快的一類水產(chǎn)食品。經(jīng)多年的研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚完全適于用作魚糜加工的原料［2-3］，但其產(chǎn)品普遍存在著彈性低、口感差等問題。國內(nèi)外大量研究表明，組織蛋白酶L是主要影響魚糜制品凝膠特性的內(nèi)源性蛋白酶之一［4-5］。比如，An等報道在太平洋牙鱈魚糜中，組織蛋白酶L是魚糜中殘存較多和具有內(nèi)肽酶活性的組織蛋白酶［4］。雖然為非肌原纖維蛋白結合蛋白酶，組織蛋白酶L活性并未能在魚肉漂洗工藝中完全去除［6］，在凝膠化過程中亦降解肌球蛋白，從而造成魚糜凝膠劣化現(xiàn)象的產(chǎn)生。因此，本實驗對影響鯉魚組織蛋白酶L活性的凍藏條件、漂洗工藝、熱處理、pH處理等因素進行了研究，同時初步探討了不同食品組分對鯉魚組織蛋白酶L活性的抑制作用，以期提高鯉魚魚糜制品的凝膠特性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮鯉魚 每尾重800±50g，購于杭州市朝暉農(nóng)貿(mào)市場，擊暈，冰鮮運至實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液提取 取鯉魚背部白肌肌肉10.00g，加入已預冷的4倍體積25mmol/L乙酸鈉緩沖液（含5mmol/L L-Cys，pH5.0）進行勻漿，置于4℃下提取1.5h，4℃離心（10000r/min，20min），抽濾，濾液即為鯉魚組織蛋白酶L的粗酶提取液。

1.2.2 鯉魚組織蛋白酶L的活性測定 組織蛋白酶L活性參照Barret方法并加以改進［7］。取250μL酶液，依次加入250μL Brij35溶液（0.1%）、250μL反應緩沖液（340mmol/L乙酸鈉-60mmol/L乙酸-4mmol/L EDTA-2Na，含8mmol/L DDT，pH5.5）后，加入Z-Phe -Arg-AMC底物溶液至終濃度為5μmol/L，混勻后于40℃反應10min，終止反應，離心取上清液，利用多功能酶標儀進行測定其熒光值，所用的激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為460nm。

一個酶活單位（U）定義為在反應溫度（40℃）及pH6.0下，能夠在1min內(nèi)水解底物并釋放出1nmol AMC產(chǎn)物的酶活性量（1nmolAMC/min）。

1.2.3 鯉魚的凍藏實驗 取鯉魚背部白肌，切成塊狀（40mm×20mm×15mm），置于-20℃下凍藏，定期取樣測定其組織蛋白酶L的活性。

1.2.4 鯉魚魚糜的制備 參考王錫昌方法制備魚糜［8］。將鯉魚背部肌肉攪碎，按魚∶水為1∶8比例依次進行2次清水漂洗和0.15%鹽水漂洗，對各個階段的魚肉分別進行取樣，測定其組織蛋白酶L的活性。

1.2.5 鯉魚組織蛋白酶L的穩(wěn)定性實驗 參照李樹紅的方法［9］，對粗酶液進行酸化處理后，離心所得上清液進行40%和80%硫酸銨分級沉淀，收集沉淀，溶解、透析，所得透析液用于組織蛋白酶L的穩(wěn)定性實驗。

1.2.5.1 熱穩(wěn)定性實驗 將上述處理的組織蛋白酶L酶液分別置于20、30、40、50、60、70、80℃下加熱處理，每隔一定時間取樣，冷卻后測定其活性。

1.2.5.2 pH穩(wěn)定性實驗 將上述處理的組織蛋白酶L酶液分別調(diào)整pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，于20℃下處理30min后，回調(diào)pH至6.0，測定其活性。

1.2.6 組織蛋白酶L的抑制實驗 取250μL酶液，依次加入250μL Brij35溶液（0.1%）、250μL反應緩沖液后，加入不同濃度的食品組分，然后加入Z-Phe -Arg-AMC（底物溶液至終濃度為5μmol/L），混勻后于40℃反應10min，終止反應，離心取上清液，利用多功能酶標儀進行測定其熒光值，所用的激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為460nm。

2 結果與討論

2.1 凍藏對鯉魚組織蛋白酶L活性的影響

魚類鮮水產(chǎn)品極易腐敗變質(zhì)，且其生產(chǎn)具有明顯的季節(jié)性，產(chǎn)量高度集中，因此加工中常采用凍藏方式保存魚類原料。本實驗將鯉魚置于-20℃下進行貯藏，動態(tài)檢測了其組織蛋白酶L活性的變化，結果如圖1所示。由圖1可知，凍藏期間鯉魚組織蛋白酶L活性呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，經(jīng)凍藏6個月后，其活性由 4.83U/g魚肉降至 3.83U/g魚肉，下降了20.81%，這表明了鯉魚組織蛋白酶L在凍藏過程中具有較強的穩(wěn)定性。J Shann-tzong等亦報道了相似的結果，鯖魚魚糜在-40℃環(huán)境中貯藏8周后，其組織蛋白酶B和L活性殘存了約80%［10］。

圖1 鯉魚凍藏后組織蛋白酶L的活性變化

2.2 漂洗對鯉魚組織蛋白酶L活性的影響

魚糜加工過程中，一般采用2次清水漂洗和鹽水漂洗方式以去除魚肉中水溶性蛋白，從而達到提高產(chǎn)品彈性和白度的目的。實驗考察了鯉魚魚糜加工中組織蛋白酶L的殘存情況，結果如圖2。研究發(fā)現(xiàn)，漂洗工藝可在一定程度上降低魚肉中組織蛋白酶L的活性，但并不能完全去除該酶，該結果與李樹紅［9］等的報道相一致。經(jīng)第一次清水漂洗后，魚肉中組織蛋白酶L活性顯著減少，下降了34.58%；經(jīng)2次清水漂洗和0.15%鹽水漂洗后，鯉魚魚肉中仍殘存了45.65%的組織蛋白酶L。

圖2 漂洗對鯉魚組織蛋白酶L的活性影響

2.3 鯉魚組織蛋白酶L的穩(wěn)定性實驗

2.3.1 加熱處理對鯉魚組織蛋白酶L活性的影響已有研究表明，組織蛋白酶是一類耐熱性半胱氨酸蛋白酶，在魚糜加熱膠凝過程中可能殘存一定的活性，從而導致凝膠劣化的產(chǎn)生［11］。由圖3可知，鯉魚組織蛋白酶L具有較強的耐熱性，40℃下加熱處理30min和60min后，組織蛋白酶 L活性分別降至68.78%和59.69%；50℃下加熱處理30min和60min后，組織蛋白酶L活性分別降至38.26%和33.97%；而加熱溫度大于60℃時，鯉魚組織蛋白酶L基本失活，其活性降至4%以下。

圖3 鯉魚組織蛋白酶L的熱穩(wěn)定性

2.3.2 pH對鯉魚組織蛋白酶L活性的影響 本實驗研究了不同pH環(huán)境下鯉魚組織蛋白酶L活性的變化，結果如圖4所示。研究表明，鯉魚組織蛋白酶L具有較強的耐酸性，pH4.5～5.5下處理30min，其活性基本保持85%以上；pH3.0下處理30min，組織蛋白酶L仍保留了47.62%活性；當pH≥7.0后，鯉魚組織蛋白酶L活性發(fā)生明顯下降，其相對活性僅為0.62%。該結果與鰱魚組織蛋白酶的pH穩(wěn)定性相類似［12］。

圖4 鯉魚組織蛋白酶L的pH穩(wěn)定性

2.4 食品組分對鯉魚組織蛋白酶L的抑制作用

近年來，從食品組分中篩選安全、高效的酶抑制劑已成為改善魚糜凝膠強度的研究焦點［13-15］。實驗中研究了豆科類蛋白、馬鈴薯蛋白、大米蛋白、雞蛋清蛋白、大豆異黃酮和茶多酚等食品組分對鯉魚組織蛋白酶L活性的影響，結果見圖5。由圖可知，5～30mg/mL豆科類、馬鈴薯、大米、雞蛋清等蛋白均對鯉魚組織蛋白酶L表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)良好的量效關系，其中雞蛋清蛋白對組織蛋白酶L的抑制效果最強，馬鈴薯蛋白次之，當?shù)鞍踪|(zhì)濃度為5mg/mL時，其抑制率分別為34.5%和23.6%；豆科類蛋白對鯉魚組織蛋白酶L的抑制大小分別為：黃豆＞綠豆＞紅豆＞蠶豆。此外，大豆異黃酮和茶多酚亦顯著抑制鯉魚組織蛋白酶L活性，當添加量為2mg/mL時，其抑制率分別為49.0%和38.0%。實驗結果說明，大豆異黃酮、茶多酚等雙黃酮物質(zhì)是潛在的、高效的組織蛋白酶L抑制物質(zhì)，有待于進一步深入研究其對魚糜膠凝的影響。

圖5 不同食品組分對鯉魚組織蛋白酶L的抑制效果

3 結論

3.1 經(jīng)-20℃凍藏6個月，鯉魚組織蛋白酶L活性下降了20.81%，這說明其在凍藏過程中具有較強的穩(wěn)定性。

3.2 漂洗工藝可在一定程度上降低魚肉中組織蛋白酶L的活性，但并不能將其完全去除，經(jīng)2次清水漂洗和 0.15%鹽水漂洗后，鯉魚魚肉中仍殘存了45.65%的組織蛋白酶L。

3.3 鯉魚組織蛋白酶L具有較強的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性。20～50℃下加熱處理下和pH≤7.0酸性環(huán)境中，鯉魚組織蛋白酶L仍保留了一定的活性。

3.4 豆科類、馬鈴薯、大米、雞蛋清等蛋白均對鯉魚組織蛋白酶L表現(xiàn)出明顯的抑制作用。大豆異黃酮和茶多酚亦顯著抑制鯉魚組織蛋白酶L活性，有待于進一步深入研究上述食品組分對魚糜凝膠特性的影響。

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Study on influence factors of cathepsin L in common carp

HOU Lu-na，CHEN Xue-yun，NIE Xiao-hua*，LIU Lin
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

The influence factors of cathepsin L in common carp were studied.From the results，cathepsin L in common carp exhibited strong stability and kept certain activities during the process of-20℃ frozen，20～50℃heating and acid treatment.Cathepsin L in common carp still reserved 45.65%activity after washing process. Meanwhile，cathepsin L in common carp were obviously inhibited by bean proteins，rice protein，egg protein，potato protein，polyphenols and soy isoflavones in a dose-dependent manner.

common carp；cathepsin L；influence factors

TS254.1

A

1002-0306（2010）11-0075-03

2010-03-11 *通訊聯(lián)系人

侯魯娜（1983-），女，碩士研究生，主要從事食品生物技術方面的研究。

國家863項目（2007AA09Z442）；浙江省自然科技項目基金（Y307132）。