莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r的毒性作用

張晗,沈丹丹,穆淑梅,郭明申,康現(xiàn)江

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071002)

莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r的毒性作用

張晗,沈丹丹,穆淑梅,郭明申,康現(xiàn)江

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071002)

研究莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r的生殖毒性,為其養(yǎng)殖水體水質(zhì)管理提供依據(jù).以概率作圖法計(jì)算日本沼蝦24,48,72和96 h的半致死質(zhì)量濃度,并觀察各暴露組卵巢組織結(jié)構(gòu)的變化.通過脅迫實(shí)驗(yàn),研究莠去津?qū)Ρ┞? d和8 d的日本沼蝦卵巢乳酸脫氫酶(LDH)比活力的影響.結(jié)果表明:22℃時(shí),莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r24,48,72和96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為134.23,90.24,52.57和46.36 mg/L,安全質(zhì)量濃度為4.64 mg/L;卵巢急性毒性實(shí)驗(yàn)切片顯示,隨莠去津質(zhì)量濃度的增大,卵母細(xì)胞間隙增大,胞體膨大、變形.脅迫實(shí)驗(yàn)表明,低質(zhì)量濃度莠去津在短時(shí)間內(nèi)對(duì)卵巢LD H活力有誘導(dǎo)作用,當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.46 m g/L時(shí),LD H活力明顯受到抑制.本研究提示,莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r具有生殖毒性作用.

莠去津;半致死質(zhì)量濃度;乳酸脫氫酶比活力;卵巢;日本沼蝦

莠去津(atrazine),又名阿特拉津,化學(xué)名為2-氯-4-乙胺基-6-異丙氨基-1,3,5-三嗪,是一種選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型苗前、苗后除草劑[1].因價(jià)格低廉,在土壤中保留時(shí)間長被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[2].但同期環(huán)境毒理學(xué)研究表明,莠去津具有內(nèi)分泌干擾作用,并于1997年被世界野生動(dòng)物基金會(huì)(WWF)列為環(huán)境荷爾蒙物質(zhì)[3],因此莠去津?qū)︷B(yǎng)殖水體具有潛在的影響.目前,有關(guān)莠去津的毒性研究多見于大鼠[2,4]、小鼠[5]、斑馬魚[1,6]、鯽魚[7-9]等,而對(duì)淡水蝦的毒性研究尚未見報(bào)道.日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense),俗稱青蝦或河蝦,隸屬甲殼綱,十足目,長臂蝦科,其肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)豐富,是我國重要的淡水蝦之一.本研究以雌性日本沼蝦為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分析水體中莠去津的毒性作用,旨在為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖與水質(zhì)管理提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

日本沼蝦于2009年5月購自河北省安新縣白洋淀水產(chǎn)市場.挑選出雌蝦,置于水族箱暫養(yǎng)7 d.取體色正常、大小均勻、反應(yīng)靈敏的成熟雌性個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)用蝦,平均體長為(3.67±0.30)cm,平均體重為(1.58±0.08)g.暫養(yǎng)期間充氣泵24 h不間斷充氣,養(yǎng)殖用水為曝氣1周的去氯自來水,水溫為(22±2)℃,溶解氧大于5 mg/L,每天定時(shí)投喂2次干飼料.暫養(yǎng)期間無蝦死亡.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 莠去津的配制

將莠去津(濟(jì)南科賽基農(nóng)有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%)溶于二甲基亞砜,配制成質(zhì)量濃度為183.0 mg/m L的母液,暴露時(shí)稀釋成所需質(zhì)量濃度,二甲基亞砜的終體積分?jǐn)?shù)小于0.5‰.

1.2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

將雌性日本沼蝦隨機(jī)分為6個(gè)不同質(zhì)量濃度莠去津暴露組、溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,莠去津暴露組的質(zhì)量濃度分別為25.0,32.0,42.3,54.9,71.4和91.5 mg/L,溶劑對(duì)照組的二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)為0.5‰,每組設(shè)3個(gè)平行.實(shí)驗(yàn)在35.5 cm×15.5 cm×15.0 cm的玻璃缸中進(jìn)行,每缸隨機(jī)放10尾蝦,水量為6 L.實(shí)驗(yàn)期間不投餌,保持連續(xù)微充氣.實(shí)驗(yàn)過程中每24 h觀察并記錄蝦的中毒癥狀,去除死亡個(gè)體,實(shí)驗(yàn)暴露96 h.根據(jù)存活情況以概率作圖法計(jì)算莠去津24,48,72和96 h的半致死質(zhì)量濃度.根據(jù)公式ρ=0.1x計(jì)算莠去津?qū)θ毡菊游r的安全質(zhì)量濃度[10],其中x為日本沼蝦96 h的半致死質(zhì)量濃度.

1.2.3 卵巢組織結(jié)構(gòu)觀察

96 h實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,選取急性毒性實(shí)驗(yàn)中各組存活的蝦,冰上麻醉后,迅速取出卵巢,放入Bouin's固定液中固定24 h.常規(guī)6μm厚石蠟切片,HE染色,Olympus BX51觀察拍照記錄.

1.2.4 脅迫實(shí)驗(yàn)

為保證實(shí)驗(yàn)期間藥物對(duì)蝦的安全性,根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,莠去津的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度設(shè)在安全質(zhì)量濃度之內(nèi).實(shí)驗(yàn)在35.5 cm×15.5 cm×15.0 cm的玻璃缸中進(jìn)行,每缸隨機(jī)放10尾蝦,水量為6 L.莠去津的質(zhì)量濃度分別為0,0.10,0.23,0.46,2.32和4.64 mg/L,每組設(shè)3個(gè)平行,實(shí)驗(yàn)期間保持連續(xù)微充氣,無蝦死亡.

1.2.5 LD H比活力測(cè)定

分別于4 d和8 d稱取不同質(zhì)量濃度莠去津脅迫下的蝦卵巢組織0.1～0.3 g,置于離心管中,加入4倍體積4℃預(yù)冷的10 mmo l/L,p H 6.5的KH2PO4-K2HPO4緩沖液.將組織剪成懸粒狀后進(jìn)行超聲波細(xì)胞粉碎(工作時(shí)間10 s,間隔時(shí)間4 s,連續(xù)工作5次).勻漿液于4℃高速冷凍離心機(jī)中以8 000 r/m in離心20 min,取上清液用于蛋白含量測(cè)定和LDH比活力測(cè)定.

LDH活力測(cè)定以丙酮酸為底物,采用紫外分光光度法[11].蛋白含量測(cè)定以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用考馬斯亮藍(lán)法[11].

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,各統(tǒng)計(jì)結(jié)果均采用SPSS 12.0進(jìn)行分析.單因素方差分析采用One-Way ANOVA模塊,組間比較采用SN K法.M icrosof t Office Excel 2003用于圖表制作.

2 結(jié)果

2.1 莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r的急性毒性

不同質(zhì)量濃度莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r的急性毒性作用如表1所示.當(dāng)莠去津的質(zhì)量濃度為25.0 m g/L時(shí),實(shí)驗(yàn)期間無蝦死亡.隨莠去津質(zhì)量濃度增加,各時(shí)間段死亡率均呈上升趨勢(shì);相同質(zhì)量濃度莠去津暴露組的死亡率隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長而增加;至莠去津的質(zhì)量濃度為91.5 mg/L時(shí),24 h即無存活蝦.

表1 不同質(zhì)量濃度莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r死亡率的影響Tab.1 Effect of atrazine with differentmass concentrationson mortality rate of female M.nip ponense

根據(jù)莠去津質(zhì)量濃度以及相應(yīng)的24～96 h受試蝦死亡率作回歸分析,可得到24,48,72和96 h雌性日本沼蝦死亡率y與莠去津質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)x之間的線性回歸方程和半致死質(zhì)量濃度,如表2所示.根據(jù)96 h的半致死質(zhì)量濃度,莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r的安全質(zhì)量濃度為4.64 mg/L.

表2 雌性日本沼蝦死亡率y與莠去津質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)x間的相關(guān)方程Tab.2 Correlation equation between mortality rate(y)and atrazinemass concentration logarithm(x)of female M.nip ponense

2.2 莠去津?qū)θ毡菊游r卵巢組織結(jié)構(gòu)的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察,空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組個(gè)體的卵巢組織結(jié)構(gòu)正常,卵母細(xì)胞排列緊密,胞體較大,呈卵圓形,胞核較大,清晰可見(圖1 a).隨莠去津質(zhì)量濃度增加,卵巢組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度異常.當(dāng)莠去津質(zhì)量濃度為32.0 m g/L時(shí),卵母細(xì)胞間出現(xiàn)間隙,排列不規(guī)則,卵母細(xì)胞胞體略有膨脹,出現(xiàn)輕微變形(圖1 b);當(dāng)莠去津質(zhì)量濃度為54.9 mg/L時(shí),卵母細(xì)胞間隙增大,胞體膨脹加劇,細(xì)胞變形(圖1 c);至莠去津質(zhì)量濃度達(dá)71.4 m g/L時(shí),卵巢的組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯異常,卵母細(xì)胞排列混亂,胞體明顯變形(圖1 d).實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),91.5 mg/L質(zhì)量濃度組已無存活個(gè)體,故未進(jìn)行卵巢組織結(jié)構(gòu)觀察.

圖1 莠去津?qū)θ毡菊游r卵巢組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of atrazine on histological structure of M.nip ponense ovary

圖2 莠去津?qū)θ毡菊游r卵巢LDH比活力的影響Fig.2 Effect of atrazine on LDH specif ic activity of female M.nipponense ovary

2.3 莠去津?qū)θ毡菊游r卵巢LDH比活力的影響

如圖2所示,莠去津?qū)θ毡菊游r卵巢LDH比活力的影響與質(zhì)量濃度和暴露時(shí)間有關(guān).當(dāng)莠去津的質(zhì)量濃度較低時(shí),LDH比活力與暴露時(shí)間相關(guān).暴露4 d的受試蝦卵巢LDH比活力受到誘導(dǎo)而增強(qiáng),在0.23 m g/L質(zhì)量濃度下酶活力最強(qiáng)(p<0.05),而暴露8 d的受試蝦卵巢LDH比活力在0.10 m g/L質(zhì)量濃度下受到抑制(p<0.05),在0.23 m g/L時(shí)酶活力無顯著變化(p>0.05);當(dāng)莠去津質(zhì)量濃度高于0.46 mg/L時(shí),暴露4 d和暴露8 d的LDH比活力均受到抑制,且當(dāng)質(zhì)量濃度高于2.32 m g/L時(shí),暴露8 d的受試蝦卵巢LDH比活力顯著低于4 d(p<0.05).

3 討論

3.1 莠去津?qū)θ毡菊游r的急性毒性

作用

急性毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驕y(cè)試莠去津?qū)θ毡菊游r的半致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度,預(yù)測(cè)和預(yù)防莠去津?qū)κ芗{水體中蝦的急性損傷,并為深入研究該物質(zhì)的毒性作用機(jī)理提供基礎(chǔ)資料.本研究表明,莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r96 h的半致死質(zhì)量濃度為46.36 mg/L,安全質(zhì)量濃度為4.64 m g/L.孟順龍等[12]研究發(fā)現(xiàn),莠去津?qū)溗媵~96 h的半致死質(zhì)量濃度為41.64 mg/L,安全質(zhì)量濃度為4.16 mg/L,本研究結(jié)果與此相似;而陳家長等[10]對(duì)鯽魚的研究發(fā)現(xiàn),莠去津?qū)a魚96 h的半致死質(zhì)量濃度為105.94 mg/L,安全質(zhì)量濃度為10.59 mg/L.這表明日本沼蝦對(duì)莠去津的敏感度與麥穗魚相似,而高于鯽魚.作者認(rèn)為該現(xiàn)象可能與物種本身的特性有關(guān).根據(jù)農(nóng)藥毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[13],莠去津?qū)θ毡菊游r為低毒農(nóng)藥.3.2 莠去津?qū)θ毡菊游r卵巢的影響

燕飛等[14]對(duì)正常養(yǎng)殖條件下日本沼蝦卵巢的發(fā)育特征進(jìn)行了詳細(xì)報(bào)道.本研究在此基礎(chǔ)上觀察了急性毒性條件下莠去津?qū)θ毡菊游r卵巢組織結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果顯示,隨莠去津質(zhì)量濃度增大,卵細(xì)胞間隙增大,胞體膨大、變形.該現(xiàn)象表明高質(zhì)量濃度(≥42.3 mg/L)莠去津可導(dǎo)致日本沼蝦卵巢組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變,從而抑制其生殖功能.研究表明,莠去津可使體外培養(yǎng)的倉鼠卵巢細(xì)胞染色體斷裂[15],大鼠卵巢細(xì)胞分裂和增殖減慢[16].低劑量長時(shí)間莠去津作用對(duì)日本沼蝦卵巢的潛在毒性影響有待深入研究.

LDH是細(xì)胞內(nèi)糖酵解中的一種重要限速酶,可催化乳酸氧化成丙酮酸,從而完成葡萄糖的無氧酵解過程.卵巢組織LDH比活力可反映出卵巢的代謝狀況,對(duì)評(píng)價(jià)機(jī)體的健康狀況具有重要意義.本脅迫實(shí)驗(yàn)顯示,低質(zhì)量濃度莠去津在短時(shí)間內(nèi)對(duì)卵巢LDH活力有誘導(dǎo)作用,當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.46 mg/L時(shí),LDH活力明顯受到抑制,且呈劑量-效應(yīng)負(fù)相關(guān).雖然本脅迫實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度在安全質(zhì)量濃度之內(nèi),但在莠去津長期存在狀況下仍可能對(duì)卵巢細(xì)胞造成慢性毒性損傷,影響其正常生理功能,使LDH活性降低.

綜上所述,在22℃時(shí),莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r96 h的半致死質(zhì)量濃度為46.36 mg/L,安全質(zhì)量濃度為4.64 mg/L.莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r具有低毒性作用并可影響其生殖能力.

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(責(zé)任編輯:趙藏賞)

Toxic Effect of Atrazine on Female M acrobrachium nip ponense

ZHANGHan,SHEN Dan-dan,MU Shu-mei,GUO Ming-shen,KANG Xian-jiang
(Co llege of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China)

Rep roductive toxic effects of atrazine on femaleMacrobrachiumnipponensew ere studied to p rovide evidence fo r the water quality management of aquaculture.Semi-lethal mass concentrations of atrazine toM.nipponenseat 24,48,72 and 96 h w ere calculated by p robability m apping.The changes of ovarian tissue structure in each exposure group were observed.Ovarian lactate dehyd rogenase(LDH)specific activity at the atrazine exposure of 4 days and 8 days was detected by stress experiment.The results showed that the semi-lethal mass concentration of atrazine toM.nipponenseat 24,48,72 and 96 h at 22℃w ere 134.23,90.24,52.57 and 46.36 m g/L,respectively,and the safe mass concentration w as 4.64 mg/L.The ovarian sections in acute toxicity test show ed that the intercellular space of oocytes increased and the cell bodies enlarged and deformed w ith the increase of the mass concentration of atrazine.The stress experiment demonstrated that atrazine at a low mass concentration increased ovarian LDH specific activity in a sho rt time.How ever,atrazine at the mass concentration above 0.46 m g/L inhibited the ovarian LDH specific activity obviously.The study indicated that atrazine had the rep roductive toxic effects on femaleM.nipponense.

atrazine;semi-lethal mass concentration;LDH specific activity;ovary;Macrobrachium nipponense

S 966.12;S 917.4

A

1000-1565(2010)06-0701-05

2009-11-02

河北大學(xué)引進(jìn)人才博士基金資助項(xiàng)目(2009-176)

張晗(1978—),女,內(nèi)蒙古包頭人,河北大學(xué)講師,主要從事水生動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究.

康現(xiàn)江(1964—),男,河北邯鄲人,河北大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師,主要從事水生動(dòng)物生殖生物學(xué)研究.