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    肺痹湯2號對二氧化硫染毒小鼠肺損傷的干預(yù)研究

    2020-08-07 10:16:14劉艷芳牛潔吳志松劉浩歌焦揚
    環(huán)球中醫(yī)藥 2020年7期
    關(guān)鍵詞:染毒肺氣灌胃

    劉艷芳 牛潔 吳志松 劉浩歌 焦揚

    隨著全球工業(yè)化進程的推進,大氣污染日益嚴重。二氧化硫(SO2)是大氣中最常見的污染物之一,研究表明[1-2],大氣SO2污染可增加呼吸系統(tǒng)發(fā)病率和死亡率。近年來國內(nèi)外學者對SO2的毒理作用進行了實驗研究,通過建立吸入SO2染毒的動物模型發(fā)現(xiàn),SO2進入呼吸系統(tǒng)后可以造成肺組織損傷,引發(fā)肺組織炎癥反應(yīng)[3]。應(yīng)用中醫(yī)藥可以干預(yù)炎性損傷過程,中醫(yī)藥對SO2損傷是否有預(yù)防或治療的作用,目前這方面的研究寥寥無幾。本課題組以中醫(yī)學理論對SO2等細顆粒物污染加以分析,認為它不同于傳統(tǒng)中醫(yī)理論的六淫邪氣、疫癘之邪,是一種新型的外來毒邪,存在于無法控制的環(huán)境空氣中,與呼吸之氣同在,活的生物體不可避免要吸入,因而危害范圍廣,預(yù)防、治療難度大。對機體的損害具有不確定性,潛伏期長[4]。本實驗通過觀察肺痹湯2號對SO2染毒小鼠肺損傷炎癥因子的干預(yù)作用,探索了中藥影響SO2染毒小鼠肺損傷的部分機制,從而為SO2污染的防治提供理論基礎(chǔ),為研發(fā)防治SO2肺損傷的純中藥制劑提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要實驗材料

    1.1.1 實驗動物及分組 雄性ICR小鼠48只,體重(20±2)g。小鼠購買于維通利華實驗動物發(fā)展有限公司(實驗動物合格證號:11400700059072),寄養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所動物房,自由進食和飲水,觀察檢疫、適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后,稱重,隨機分為4組,即空白對照組、模型組、中藥預(yù)防組、中藥治療組,每組12只。

    1.1.2 實驗主要儀器 小鼠染毒箱 (PSU材質(zhì),規(guī)格330 mm×215 mm×200 mm,北京丹瑞林科技發(fā)展有限公司),全自動多功能酶標儀(Multiskan MK3,Thermo,USA),電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A,天津泰斯特),恒溫振蕩搖床(MH-1,kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER),高速冷凍離心機(Hettich德國),紫外分光光度計(上海尤尼柯公司UV-2000),熒光定量PCR儀(ABI7500),電泳儀、電泳槽(北京六一儀器廠試管),凝膠成像儀(Tanon-6600 天能公司),分光光度計(UV-2000,上海尤尼柯公司),微量移液器等。

    1.1.3 主要藥品及試劑 肺痹湯2號方顆粒:由生黃芪、紅景天、金銀花、黃芩、丹參、生甘草組成,劑量比例為1.5∶1.5∶1.5∶1∶1∶1。使用北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供的中藥配方顆粒進行本研究。染毒氣體:高壓液化SO2,純度99.99%,由北京海普科技有限公司提供。10%甲醛、蘇木素精、一氧化汞、硫酸鋁鉀、無水乙醇、蒸餾水、5%冰乙酸、伊紅、95%乙醇、蒸餾水、鹽酸、酒精、中性樹膠、二甲苯。白介素-6 (interleukin-6,IL-6)測定試劑盒、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green PCR Mixture、Dnase 1均由康為世紀生物科技有限公司提供。

    1.2 造模、給藥及取材方法

    1.2.1 染毒時間 對模型組、中藥治療組、中藥預(yù)防組的小鼠進行SO2靜式吸入染毒處理。吸入時間:每日上午8點~12點,連續(xù)吸入4小時,連續(xù)21天,空白對照組同時吸入過濾后的新鮮空氣。SO2吸入染毒時小鼠禁食禁水,其余時間小鼠自由進食飲水。

    1.2.2 染毒方法 本實驗中采取靜式染毒的方式,SO2濃度:(28±2)mg/m3。將小鼠分組置于小鼠染毒箱(330×215×200 mm)中,染毒箱除進氣孔外其他部位均為密封狀態(tài)。根據(jù)染毒箱大小計算出所需99.99%SO2的體積,通過針管抽取相應(yīng)體積的99.99%,經(jīng)進氣孔打入染毒箱后,迅速密封住進氣孔,待SO2在染毒箱中擴散一段時間后再開啟進氣孔。通過泵吸式SO2檢測儀監(jiān)測染毒箱中SO2濃度,使SO2濃度保持在(28±2)mg/m3范圍內(nèi)。熏氣染毒結(jié)束后,在出氣孔處連接一負壓吸引器,負壓吸引器的另一頭通向飽和碳酸氫鈉溶液,以回收SO2氣體,以免造成實驗室空氣污染。

    1.2.3 給藥方法 按照人與小鼠體表面積進行換算,給藥劑量是成人臨床劑量的等效劑量。中藥治療組自染毒處理后一周,既第8天起開始予肺痹湯2號方溶液10 mL/kg·bw灌胃,至第21天止,共灌胃14天,以模擬中藥治療SO2污染損傷;中藥預(yù)防組自染毒處理前一周起,予肺痹湯2號方溶液10 mL/kg·bw灌胃,至染毒處理后第21天止,共灌胃28天,以模擬應(yīng)用中藥預(yù)防SO2肺損傷??瞻讓φ战M及模型組從染毒處理前一周到染毒處理后第21天,予0.9%生理鹽水10 mL/kg·bw灌胃,共灌胃28天。

    1.2.4 動物處死及取材 染毒處理后第21天結(jié)束之后,動物禁食、自由飲水20個小時,于次日早上8點,稱重后以脫頸椎法處死小鼠。立即打開小鼠胸腔,肉眼觀察雙肺的形態(tài)、質(zhì)地、顏色及有無明顯的肺纖維化結(jié)節(jié)等改變。以5 mL冰冷生理鹽水從右心室處注入,通過肺循環(huán)灌洗肺臟,反復(fù)幾次,至雙肺呈白色,立即將肺臟采出,稱重。取小鼠左側(cè)肺臟,在10倍于組織重的冰冷生理鹽水中用不銹鋼剪將肺組織剪碎,用玻璃勻漿器在0~4℃下研磨制成勻漿液。勻漿液用Hettich高速冷凍離心機在4℃下12000 rpm離心5分鐘,取上清液即得到肺組織的粗酶提取液,按相應(yīng)試劑盒說明書用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法進行IL -6、TGF-β1檢測。四組小鼠中每組選取6只小鼠用Real time-PCR方法檢測小鼠肺臟組織中IL -6 mRNA、TGF-β1 mRNA、乳腺復(fù)原蛋白-39(breast recovery protein-39,BRP-39) mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。

    1.3 統(tǒng)計學處理

    2 結(jié)果

    2.1 中藥肺痹湯2號方顆粒對染毒小鼠肺組織IL-6的影響

    與空白對照組相比,吸入SO2的模型組小鼠肺組織內(nèi)IL-6、IL -6 mRNA含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,中藥治療組及中藥預(yù)防組小鼠肺組織內(nèi)IL-6、IL -6 mRNA含量均有下降趨勢,但統(tǒng)計學上未見顯著意義。見表1。

    表1 各組小鼠肺組織IL-6及IL-6 mRNA含量比較

    2.2 中藥肺痹湯2號方顆粒對染毒小鼠肺組織TGF-β1的影響

    與空白對照組相比,吸入SO2的模型組小鼠肺組織內(nèi)TGF-β1、TGF-β1 mRNA含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,中藥預(yù)防組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA含量顯著下降(P<0.05)。見表2。

    表2 各組小鼠肺組織TGF-β1及TGF-β1 mRNA含量比較

    2.3 中藥肺痹湯2號方顆粒對染毒小鼠肺組織BRP-39 mRNA的影響

    與空白對照組相比,吸入SO2的模型組小鼠肺組織內(nèi)BRP-39 mRNA含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,中藥預(yù)防組小鼠肺組織BRP-39 mRNA含量顯著下降(P<0.05)。見表3。

    表3 各組小鼠肺組織BRP-39 mRNA含量

    3 討論

    SO2對組織的致炎作用是其毒理作用重要機制[5]。應(yīng)用中醫(yī)藥是否可以干預(yù)炎性損傷過程,目前這方面的研究很少。通過實驗研究證明,在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下,中藥經(jīng)過配伍形成的方劑肺痹湯 2 號可以促進 SO2染毒小鼠肺組織炎性滲出的吸收。

    SO2污染存在于無法控制的環(huán)境空氣中,是一種外來毒邪。SO2損傷人體先經(jīng)鼻咽,入肺后直接消耗肺氣,損傷正氣,影響肺之宣發(fā)、肅降;對于宿有肺疾之人,其氣本虛,SO2可致肺氣更虛,導(dǎo)致疾病癥狀加重或誘發(fā)宿疾,使氣血津液運行失常,產(chǎn)生氣滯、痰凝、血瘀等病理變化。針對以上對于病因病機的分析,應(yīng)以扶正祛邪為基本治療原則,故立治法為:補氣解毒,化痰通絡(luò),制定肺痹湯2號方。

    肺痹湯2號方是由全國名老中醫(yī)周平安教授的經(jīng)驗方肺痹湯化裁而來。周平安教授用此方治療肺纖維化之肺氣虧虛,痰瘀阻絡(luò)證,臨床收效甚宏[6-7]。周平安教授認為肺間質(zhì)纖維化的病機以肺氣虛損為內(nèi)因,外邪乘肺虛而內(nèi)舍于肺,肺氣虛無力鼓動血脈則血運遲緩,又有邪氣閉阻肺絡(luò),氣血失和,氣血失于流暢,日久血液瘀滯,與痰濁搏結(jié),痰瘀痹阻肺絡(luò)而發(fā)。病機與SO2肺損傷相近,肺氣虛損,邪氣傷肺,瘀血、痰濁等繼發(fā)的病理產(chǎn)物互相搏結(jié),留于肺絡(luò),治療需補益肺氣,化痰通絡(luò)。不同之處在于治療SO2肺損傷除補肺氣,化痰通絡(luò)外,還需解毒祛邪,故將肺痹湯化裁,減少其化痰通絡(luò)之藥味,增強解毒祛邪之力,故定名為肺痹湯2號。方中黃芪補益肺脾之氣,益衛(wèi)固表,升陽舉陷,利水消腫,托毒生肌; 紅景天補益肺氣、健脾補虛、收澀止血、活血散瘀,與黃芪相配合補益肺氣,扶助正氣,二者共為君藥。金銀花清熱解毒,散癰消腫,疏散風熱,黃芩清熱燥濕,瀉火解毒,與金銀花配合增強解毒祛邪之力,二者為臣藥。丹參活血通經(jīng),涼血消腫,在本方中為佐藥,針對肺氣受損、血行遲滯的病機變化。甘草具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、調(diào)和諸藥的作用,既可助黃芪補益肺氣,又能祛痰止咳解毒,還可調(diào)和諸藥,為佐使藥。全方共奏補益肺氣、解毒、化痰、活血之功。

    近年來許多研究證明,SO2進入呼吸系統(tǒng)后可以造成肺組織損傷,SO2及其衍生物可激活血液淋巴細胞和肺泡巨噬細胞,產(chǎn)生大量致炎細胞因子[8],IL-6、TGF-β1、BRP-39在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,在小鼠的肺部炎癥和損傷中起著關(guān)鍵的作用。IL-6的基因表達失常是解釋許多疾病的基礎(chǔ),IL-6主要產(chǎn)生于激活的巨噬細胞,可促進炎癥介質(zhì)釋放,它既能調(diào)節(jié)T細胞、B細胞和單核-巨噬細胞的免疫活性,又參與某些免疫病理的發(fā)生[9]。TGF-β1是一種抗炎因子,可以抑制T、B細胞增殖,減少主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類抗原表達,減輕局部炎癥反應(yīng)。TGF-β是放射致肺損傷過程中最重要的細胞因子,它可趨化炎癥細胞、成纖維細胞,促進細胞合成IL-1、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α),同時還調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM) 包括I、Ⅲ型膠原蛋白的合成增加,減少ECM的降解。BRP-39是存在于哺乳動物中的一種殼質(zhì)酶類似物蛋白,被認為是在哺乳動物中的一種表型, 在小鼠稱為BRP-39[10], 在人的同系物則稱為甲殼質(zhì)酶蛋白-40(chitinase protein-40,YKL-40),YKL-40表達和分泌的增加被認為與許多以組織重構(gòu)、炎癥反應(yīng)和纖維化為特征的疾病相關(guān),如哮喘、肺結(jié)節(jié)病、過敏性皮炎、腸道炎等炎癥性疾病等。YKL-40能抑制氧化劑誘導(dǎo)的肺損傷,增加對Th2免疫的適應(yīng)性,調(diào)節(jié)凋亡,刺激交替性巨噬細胞的活化,并促進組織纖維化和傷口愈合,其參與多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制。與空白組小鼠相比,模型組小鼠肺組織的IL-6、IL-6 mRNA 、TGF-β1、TGF-β1 mRNA、BRP-39 mRNA含量顯著升高,表明了SO2對肺組織細胞的致炎作用。中藥預(yù)防組小鼠與模型組小鼠相比, TGF-β1、TGF-β1 mRNA、BRP-39 mRNA含量顯著減少,說明肺痹湯2號對于小鼠肺損傷后炎癥因子高表達有一定的抑制作用,表明肺痹湯2號對小鼠肺組織損傷起到了一定的保護作用。

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