在非小細(xì)胞肺癌組織中stathmin蛋白的表達(dá)及與含紫杉方案化療敏感性的關(guān)系

叢光東 李建 杜亞明* 王中彬

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，也是病死率最高的惡性腫瘤之一，其中大約有80%為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），且5年生存率很低，不足15%[1]。化療在肺癌的治療中有舉足輕重的作用，但是相同的藥物，用在臨床期別相同的患者身上，常會(huì)產(chǎn)生截然不同的效果，提示臨床療效取決于藥物與腫瘤組織的相互作用。藥物遺傳學(xué)（pharmacogenetics）和藥物基因組學(xué)（pharmacogenomics）的迅速發(fā)展已經(jīng)證明：腫瘤組織的基因表達(dá)情況與NSCLC化療的療效相關(guān)。因此，根據(jù)患者腫瘤組織的基因表達(dá)情況選用特異的對(duì)其最佳的化療藥物，以提高化療的敏感性及延長(zhǎng)生存期，并將毒副反應(yīng)降到最低成為可能[2]。隨著對(duì)肺癌的研究不斷深入，對(duì)肺癌的治療方法也在不斷的提高，目前，已提倡肺癌的治療向個(gè)體化的方向發(fā)展，但是現(xiàn)在對(duì)個(gè)體化的治療還比較盲目，不能做到有的放矢。因此，加強(qiáng)對(duì)肺癌的特異性因子的研究就顯得尤其重要，檢測(cè)并分析其指標(biāo)也對(duì)指導(dǎo)臨床的治療有重要意義。

stathmin蛋白是近年發(fā)現(xiàn)的在細(xì)胞的增殖和分化中十分重要的可溶性蛋白質(zhì)，對(duì)于細(xì)胞外信號(hào)起一個(gè)中繼站的作用，故命名為stathmin[3]。其可以通過影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的聚合與解聚而干擾紫杉醇類藥物的作用底物，從而影響此類藥物的療效[4,5]。微管蛋白是細(xì)胞骨架的重要組成部分。其中3型β微管蛋白（β-tubulinⅢ）與作用于微管的化療藥物敏感性有最密切的關(guān)系[6]。

本課題通過SP二步法聯(lián)合測(cè)定NSCLC患者瘤組織內(nèi)stathmin蛋白的表達(dá)與臨床化療效果的觀察，分析二者之間的關(guān)系，以期為個(gè)體化治療提供藥物選擇的參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

123例NSCLC組織均為遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科術(shù)后存檔標(biāo)本（肺癌組），術(shù)前未經(jīng)任何放化療，均有明確病理診斷，術(shù)后予以藥物輔助化療。123例患者中男性88例，女性35例，年齡34～80歲，平均58.49歲。所有標(biāo)本按WHO （1981）組織學(xué)分型分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：鱗癌75例（其中高分化11例，中分化47例，低分化17例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的31例），腺癌48例（其中高分化33例，中分化10例，低分化5例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例）。所有病例均按國(guó)際肺癌TNM分期（UICC，5thed，1997）：Ⅰ期68例，Ⅱ期42例，Ⅲ期11例，Ⅳ期2例，其中用含紫杉類化療藥物輔助化療者32例。另選15例炎性假瘤組織為良性對(duì)照（良性組）。全部標(biāo)本常規(guī)固定，石蠟包埋，5μm切片。

上述123例中32例為用含紫杉類化療藥物化療的晚期非小細(xì)胞肺癌患者的標(biāo)本，化療方案：TP：（paclitaxel：135 mg/m2d1，carboplatin：AUC 5～6 d1 q21d ）。所有患者至少接受2周期以上的化療，并且具備完整的臨床隨訪資料。

1.2 檢測(cè)方法

鼠抗人stathmin單克隆抗體（北京中杉生物科技有限公司）。用免疫組織化學(xué)二步法對(duì)兩組樣本中的stathmin蛋白進(jìn)行檢測(cè)。用已知的stathmin蛋白陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 結(jié)果判斷

隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，stathmin蛋白表達(dá)陽(yáng)性，均為在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色。用按每張切片腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的比例和著色深淺記分，行半定量分析。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例判斷：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。根據(jù)兩項(xiàng)指標(biāo)積分?jǐn)?shù)（積分＝A×B）高低分為：0分為陰性（－），1～2分為可疑（±），3～5分為弱陽(yáng)性（+），6～8分為陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。以－和±為表達(dá)陰性，+、++及+++為表達(dá)陽(yáng)性。以上所有結(jié)果的判定在雙盲法下進(jìn)行。

按WHO標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定療效：CR-病灶完全消失1個(gè)月以上。PR-腫塊縮小超過50%，時(shí)間4周以上。NC-病灶減小不到50%或無變化或增大25%以下。PD-病灶增大超過25%或出現(xiàn)新病灶。完全緩解或部分緩解者為化療有效，穩(wěn)定或疾病進(jìn)展者為化療無效。

總生存期（OS）：自化療首日至死亡或失訪日期止，以電話或門診隨訪的方式完整隨訪32例用含紫杉類化療藥物化療的晚期非小細(xì)胞肺癌患者，隨訪時(shí)間17～60個(gè)月，隨訪日期截止到2008年5月25日。觀察患者生存期（患者開始化療日至患者死亡或最后1次隨訪日期）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0軟件處理數(shù)據(jù)。率的比較用χ2檢驗(yàn)；生存曲線分析用Log-Rank檢驗(yàn)， P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組stathmin蛋白的表達(dá)情況。

NSCLC組中stathmin蛋白表達(dá)陽(yáng)性65例（52.8 %），良性組中1例（6.7%）。所以經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得出，兩種蛋白表達(dá)在肺癌組與炎性假瘤組之間均有顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 stathmin蛋白在NSCLC與對(duì)照組中的表達(dá)

2.2 stathmin蛋白表達(dá)水平與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

stathmin蛋白陽(yáng)性率在中-低分化期大于高分化期，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.91，P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組stathmin蛋白陽(yáng)性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.3，P＜0.01）；stathmin蛋白表達(dá)在年齡、性別、組織類型、分期方面無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 stathmin表達(dá)水平與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

2.3 stathmin蛋白對(duì)術(shù)后化療效果的預(yù)測(cè)

選取肺癌組中術(shù)后行含紫杉類輔助化療并具備完整隨訪資料者32例，將stathmin蛋白指標(biāo)分為陽(yáng)性、陰性兩組。其中stathmin蛋白為陽(yáng)性者16例，其1、2、3年生存率分別為68.75%、18.75%和0，中位生存期為18個(gè)月；為陰性者16例，其1、2、3年生存率為87.5%、56.25%和31.25%，中位生存期為27個(gè)月。二者1、2、3年生存率比較，χ2=5.12，P＜0.05。二者生存曲線如下，差異有顯著性（圖1）。

圖1 兩組患者的生存曲線圖

3 討 論

目前為止，NSCLC的化療效果仍然不是太理想，在目前常用的化療方案中尚未有一種方案效果顯著，肺癌細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性是影響化療療效的主要因素，多藥的耐藥（MDR）可能是導(dǎo)致NSCLC化療失敗的主要原因[7]。若能前瞻性地進(jìn)行分子指標(biāo)的檢測(cè)，預(yù)測(cè)患者對(duì)藥物的療效及預(yù)后，就可能做到個(gè)體化治療及預(yù)后的判定。

stathmin蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的在細(xì)胞的增殖和分化中十分重要的可溶性蛋白質(zhì)，其家族成員包括stathmin、SCG10、SCLI和RB3。該蛋白由149個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量19×103。stathmin蛋白為一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)蛋白，該蛋白作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在細(xì)胞分化、組織再生、修復(fù)及在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[8,9]、尤其是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性上具有重要意義[10,11]。細(xì)胞微管由微管蛋白二聚體構(gòu)成，是真核生物細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞骨架，是有絲分裂時(shí)紡錘體的基本組成單位。stathmin蛋白具有解聚微管的作用，通過調(diào)節(jié)該蛋白的表達(dá)和活性，控制細(xì)胞的增殖和分化：有絲分裂間期，活性狀態(tài)的stathmin蛋白高表達(dá)，促進(jìn)微管解聚；有絲分裂早期，stathmin蛋白磷酸化，成為非活性狀態(tài)，此時(shí)微管聚合增加，有絲分裂紡錘體形成；有絲分裂后期，stathmin蛋白去磷酸化恢復(fù)活性，促進(jìn)微管解聚，有絲分裂紡錘體解散，退出有絲分裂。Rubin等[11]研究證實(shí)，stathmin缺少的細(xì)胞中微管聚合增加，而stathmin過表達(dá)的細(xì)胞中微管聚合減少。

本研究結(jié)果顯示，stathmin蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi)，在NSCLC中表達(dá)高，并與分化程度及有無淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）；而與患者年齡、性別及腫瘤病理類型和分期無關(guān)。提示stathmin陽(yáng)性表達(dá)可能與肺癌的發(fā)展有著重要的相關(guān)性，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要的角色。其與細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)，其有可能成為人類肺癌生物治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

紫杉類化療藥物作為抗微管解聚的細(xì)胞毒類藥物，1992年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)臨床上使用。紫杉類藥物主要作用于細(xì)胞G2晚期和M期末，它雖可促進(jìn)微管蛋白裝配成微管，然而卻抑制微管的裂解，導(dǎo)致微管排列異常，使紡錘體失去正常功能而引起細(xì)胞死亡[12]。臨床上用紫杉醇治療腫瘤時(shí)，需注意到患者腫瘤細(xì)胞的基因狀態(tài)，這可能是與藥物療效有關(guān)的重要因素[13,14]。

與紫杉類化療藥物相同，stathmin蛋白的下游作用靶點(diǎn)也是微管系統(tǒng)，即在細(xì)胞分裂周期中起關(guān)鍵作用的微管蛋白、微管及紡錘體等細(xì)胞器，只是作用路徑不同，在細(xì)胞分裂間期（G0-M）末端具有抑制微管蛋白聚集的作用[15]。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明，腫瘤基因stathmin的表達(dá)程度與腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性有一定關(guān)系[16]。

本研究結(jié)果顯示，stathmin均呈陽(yáng)性時(shí)，患者生存率和生存期較均為陰性者下降（P＜0.05），提示stathmin均呈陽(yáng)性表達(dá)的患者對(duì)含紫杉化療藥的敏感性較其均呈陰性表達(dá)者差。提示我們，stathmin均呈陽(yáng)性表達(dá)時(shí)，NSCLC患者對(duì)含紫杉類的化療藥物的敏感性下降，患者術(shù)后預(yù)后較差。

綜上所述，過表達(dá)的stathmin均可引起腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉類化療藥物敏感性的降低，但目前對(duì)其具體的機(jī)制還未有一個(gè)非常明確的闡述，還有待于進(jìn)一步的研究得以證實(shí)，通過對(duì)兩種因子的檢測(cè)，我們證實(shí)了兩種因子可能作為預(yù)測(cè)患者對(duì)紫杉類藥物化療療效的指標(biāo)。這就為NSCLC患者個(gè)體化的治療提供了一定的指導(dǎo)意義，為具體的化療方案的選擇提供了幫助.但是，本實(shí)驗(yàn)只局限了與紫杉類藥物的作用關(guān)系，與其他化療藥物的關(guān)系還不明確，還需要其他學(xué)者的研究得到證實(shí)。隨著各種化療藥物耐藥機(jī)制不斷的被闡明以及逆轉(zhuǎn)耐藥策略的成熟，相信對(duì)NSCLC患者的化療就可以做到真正的有的放矢。

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