硅基芯片表面化學(xué)性質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)固定化的影響

周穩(wěn)穩(wěn) 廉 潔 胡科家 高云華 徐 百

(1中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所光化學(xué)轉(zhuǎn)換和功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190; 2中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京 100049)

硅基芯片表面化學(xué)性質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)固定化的影響

周穩(wěn)穩(wěn)1,2廉 潔1,2胡科家1,2高云華1,*徐 百1,*

(1中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所光化學(xué)轉(zhuǎn)換和功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190;2中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京 100049)

制備蛋白質(zhì)芯片的關(guān)鍵在于將蛋白質(zhì)固定到芯片表面并保持其生物學(xué)活性.本實(shí)驗(yàn)中,我們分別采用物理吸附、直接化學(xué)固定、加入間隔臂化學(xué)固定和生物親和作用固定的方法將癌胚抗原(CEA)抗體固定到硅基芯片的二氧化硅表面.基于抗原-抗體的特異性相互作用,利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)評(píng)價(jià)各種方法固定抗體的效果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在修飾有氨基的表面采用戊二醛作為偶聯(lián)試劑固定CEA抗體具有最高的偶聯(lián)效率,引入多聚賴(lài)氨酸(poly-L-lysine)作為間隔臂可以顯著增強(qiáng)固定效果,并可進(jìn)一步降低非特異性吸附.而利用生物親和作用固定CEA抗體也可獲得較好的固定效果,但是非特異性吸附較嚴(yán)重.

蛋白質(zhì)芯片; 抗體固定; 夾心反應(yīng); 酶聯(lián)免疫吸附分析; 氨基表面; 戊二醛; 多聚賴(lài)氨酸

蛋白質(zhì)芯片可用于研究蛋白質(zhì)分子之間的相互作用,在分子識(shí)別、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、質(zhì)量控制、高通量和快速檢測(cè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[1-6].構(gòu)建蛋白質(zhì)芯片的基礎(chǔ)是將特異性的蛋白質(zhì)分子(如抗體分子)固定到芯片表面并保持其生物學(xué)活性.由于蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上和化學(xué)性質(zhì)上都比DNA更復(fù)雜[7-8],在固定到固體表面的過(guò)程中容易失活,一般認(rèn)為這可能是由于固相表面的化學(xué)微環(huán)境因素導(dǎo)致了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變[9-11].此外,化學(xué)的、物理學(xué)的以及結(jié)構(gòu)上的種種差異使得各種蛋白質(zhì)在固體表面上的固定效率呈現(xiàn)很大差異[12-13].因此對(duì)芯片表面蛋白質(zhì)固定策略的研究是極其重要的.如何在不同的固相表面固定足夠多的保持生物活性的蛋白質(zhì)分子是具有挑戰(zhàn)性的工作,也是眾多蛋白質(zhì)組學(xué)研究者孜孜追求的目標(biāo)[14-20],許多研究者開(kāi)發(fā)出各種新穎的蛋白質(zhì)固定技術(shù),并取得了較好的效果.

表面化學(xué)在蛋白質(zhì)固定中扮演了一個(gè)極其重要的角色,各種固定蛋白質(zhì)的策略都離不開(kāi)對(duì)固相表面的化學(xué)修飾.首先需要在固相表面(如硅片、玻片、塑料等)衍生出化學(xué)活性的功能團(tuán),然后通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將蛋白質(zhì)分子(如抗體分子)偶聯(lián)固定到這種化學(xué)活化的固相表面.在這個(gè)過(guò)程中,如何提高偶聯(lián)的效率并保持蛋白質(zhì)分子的生物活性是主要挑戰(zhàn).目前已經(jīng)有許多不同的表面處理方法和共價(jià)偶聯(lián)方法[12,14-15,21].這些方法大致可以分為四類(lèi):(a)直接物理吸附[22-24],如在聚苯乙烯表面和聚賴(lài)氨酸表面直接吸附蛋白質(zhì)分子;(b)直接共價(jià)連接[15,25],如在短鏈氨基、巰基或羧基表面直接偶聯(lián)蛋白質(zhì)分子;(c)加入間隔臂共價(jià)連接[26-29],即在偶聯(lián)蛋白質(zhì)分子之前,先引入一層高分子,通常選擇樹(shù)枝狀高分子或具有較好生物相容性的高聚物;(d)利用生物親和作用固定蛋白質(zhì)分子[17,30-31],如先將結(jié)合蛋白A固定到固相表面,然后再利用它們與免疫球蛋白Fc段的特異性結(jié)合固定抗體分子.雖然已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道了上述不同的表面修飾方法,但是很少有文獻(xiàn)系統(tǒng)研究這些方法對(duì)蛋白質(zhì)固定化效果的影響.因此,我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)系統(tǒng)研究方案,研究了在硅基二氧化硅表面不同表面修飾方法對(duì)癌胚抗原(CEA)抗體固定的影響,以雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)評(píng)價(jià)CEA抗體的固定效果,以期優(yōu)化篩選出最佳的抗體固定策略用于蛋白質(zhì)芯片的進(jìn)一步開(kāi)發(fā).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES,99%),3-巰基丙基三甲氧基硅烷(MPTS,85%,比利時(shí)ACROS公司);3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTS, 97%,美國(guó)Alfa Aesar公司);對(duì)醛基苯甲酸(FBA, 97%),聚苯乙烯(PS,平均分子量25000),多聚賴(lài)氨酸(ε-PLL,分子量70-150 kDa),蛋白A(Protein A),蛋白G(Protein G),親和素(Avidin),生物素(D-Biotin,美國(guó)Sigma-Aldrich公司);戊二醛(GA,25%(φ)水溶液),2-嗎啉乙磺酸(MES,ultra grade),吐溫20(Tween 20,美國(guó)Merck公司);1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl,98%),N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,98+%),SMCC(4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯)/sulfo-SMCC(美國(guó)Pierce Biotechnology公司);癌胚抗原(CEA,美國(guó)Fitzgerald Industries International Inc.公司);抗癌胚抗原包被抗體(CEA Ab),生物素化抗癌胚抗原包被抗體(CEA Ab-Biotin),辣根酶標(biāo)記抗癌胚抗原標(biāo)記抗體(CEA Ab-HRP),TMB顯色液(北京博邁世紀(jì)生物技術(shù)有限公司);牛血清白蛋白(BSA,98%),小牛血清,羊抗人IgG純化抗體(≥95%),蔗糖(≥99%),海藻糖(≥99%,北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司);殼聚糖(chitosan,分子量150 kDa,脫乙酰度95%);磷酸鹽緩沖液(PBS,3.63 g Na2HPO4·12H2O和0.24 g KH2PO4溶于超純水并定容至1 L);碳酸鹽緩沖液(CB,1.59 g Na2CO3和2.93 g NaHCO3溶于超純水并定容至1 L);MES緩沖液(MES,15.92 g MES溶于900 mL超純水,再用NaOH調(diào)節(jié)pH值到6.5,最后用超純水定容至1 L);無(wú)水乙醇(分析純),甲苯(分析純),N,N-二甲基甲酰胺(DMF,分析純,北京化工廠);其他試劑為市售分析純或更高級(jí)別.

EASY pure LF超純水系統(tǒng)(美國(guó)Barnstead公司);PDC-M型等離子清洗器(成都銘恒科技發(fā)展有限公司);ZD-85氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠);JC2000C1全自動(dòng)接觸角儀(上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司);RT-2100C酶標(biāo)分析儀(深圳市雷杜電子有限公司);微反應(yīng)池(7.5 mm× 13 mm×5 mm,自制);具有200 nm厚二氧化硅膜的硅片(6.6 mm×10.7 mm×0.75 mm,北京大學(xué)微電子學(xué)系).

1.2 硅片的前處理

先用無(wú)水乙醇和去離子水交替清洗硅片3次,并用氮?dú)饬鞔蹈?然后置于等離子清洗器中處理2 min(電壓600 V,氧氣流量800 mL·min-1),使硅片表面生成一層活性的羥基(接觸角＜5°).等離子處理后的硅片應(yīng)立即進(jìn)行后續(xù)的表面化學(xué)修飾,因?yàn)檫@些活性的羥基是不穩(wěn)定的,在空氣中容易再次交聯(lián)形成硅氧橋鍵[32-33].

1.3 硅片表面不同修飾方法固定抗體

1.3.1 直接吸附抗體

將氧等離子體處理好的硅片浸入到10 mg·mL-1PS的甲苯溶液和10 mg·mL-1PLL的PBS溶液中,置于室溫下浸泡過(guò)夜,然后分別取出.PS硅片直接甩干;PLL硅片用超純水潤(rùn)洗5次,并用氮?dú)獯蹈?然后將兩種表面的硅片置于50℃烘箱中烘烤30 min,取出自然冷卻至室溫.將抗癌胚抗原(CEA)包被抗體(10 μg·mL-1,0.5%(w,質(zhì)量分?jǐn)?shù))海藻糖[15,34], CB溶液)分別滴加到兩種硅片表面,置于4℃放置過(guò)夜(如圖1(a)所示).

1.3.2 直接共價(jià)連接抗體

將氧等離子體處理好的硅片分別迅速浸入到5%(φ,體積分?jǐn)?shù))APTES的乙醇溶液,5%(φ,體積分?jǐn)?shù))GPTS的乙醇溶液,5%(φ)MPTS的乙醇溶液中并置于37℃氣浴恒溫振蕩器反應(yīng)2 h.反應(yīng)完成后用無(wú)水乙醇清洗5次,并用氮?dú)獯蹈?其中APTES硅片置于90℃烘箱中烘烤40 min.分別得到氨基硅片,環(huán)氧基硅片和巰基硅片.然后用四種方式偶聯(lián)固定抗體:(1)直接通過(guò)環(huán)氧基連接抗體,將CEA包被抗體(10 μg·mL-1,0.5%(w)海藻糖,PBS溶液)滴加到環(huán)氧基硅片表面,然后置于4℃放置過(guò)夜;(2)通過(guò)SMCC連接抗體,將巰基硅片浸泡在1 mg·mL-1SMCC的DMF溶液或sulfo-SMCC的PBS溶液中37℃反應(yīng)1 h,用無(wú)水乙醇或PBS清洗干凈后將CEA包被抗體(10 μg·mL-1,0.5%(w)海藻糖,PBS溶液)滴加到硅片表面,然后置于4℃放置過(guò)夜;(3)通過(guò)戊二醛連接抗體,將氨基硅片浸泡在5%(φ)戊二醛的PBS溶液中室溫反應(yīng)1.5 h,PBS清洗干凈后將CEA包被抗體(10 μg·mL-1,0.5%(w)海藻糖,PBS溶液)滴加到硅片表面,然后置于4℃放置過(guò)夜;(4)通過(guò)EDC/NHS活化羧基連接抗體,將氨基硅片浸泡在50 mg·mL-1對(duì)醛基苯甲酸的DMF溶液中37℃反應(yīng)1 h得到羧基化表面,DMF清洗干凈后再將羧基硅片浸泡在EDC和NHS的混合溶液中(0.4 mol· L-1EDC+0.1 mol·L-1NHS,pH 6.5,MES溶液)室溫反應(yīng)30 min,4℃冷藏MES溶液清洗干凈后再將CEA包被抗體(10 μg·mL-1,0.5%(w)海藻糖,PBS溶液)滴加到硅片表面,然后置于4℃放置過(guò)夜(如圖1 (b)示).

1.3.3 加入間隔臂共價(jià)連接抗體

按照1.3.2節(jié)的方法用APTES將硅片表面先修飾成氨基,然后將氨基硅片浸泡在5%(φ)戊二醛的PBS溶液中2 h,PBS清洗干凈后將硅片浸入到1 mg·mL-1PLL的PBS溶液(pH 7.4)或1 mg·mL-1殼聚糖的醋酸溶液(pH 6.5)中室溫反應(yīng)6 h,PBS清洗干凈后再用戊二醛將表面醛基化,然后將CEA包被抗體(10 μg·mL-1,0.5%(w)海藻糖PBS溶液)滴加到硅片表面,置于4℃放置過(guò)夜(如圖1(c)示).

1.3.4 利用生物親和作用固定抗體

按照1.3.3節(jié)的方法通過(guò)聚賴(lài)氨酸和戊二醛將親和蛋白A/G或親和素Avidin固定到硅片表面, PBS清洗后再將CEA包被抗體或CEA包被抗體-Biotin滴加到相應(yīng)的表面,然后置于4℃放置過(guò)夜(如圖1(d)示).

1.4 抗體芯片的封閉

將各種CEA包被抗體芯片分別浸入到含有10 mg·mL-1BSA的PBS溶液中,置于氣浴恒溫振蕩器上37℃溫育1 h,然后分別用0.1%(φ)PBST清洗3次,并浸泡在保護(hù)劑(5%(w)蔗糖PBS溶液)中置于4℃待測(cè).其中,通過(guò)蛋白A/G親和固定的抗體硅片(蛋白A/G-CEA抗體硅片)需先用羊抗人IgG抗體進(jìn)行封閉,然后再用BSA封閉;通過(guò)親和素-生物素親和固定的抗體硅片(Avidin-Biotin-CEA抗體硅片)需先用D-Biotin進(jìn)行封閉,然后再用BSA封閉.

1.5 抗體芯片固定效果的酶聯(lián)評(píng)價(jià)

為了評(píng)價(jià)硅片表面固定的抗體的密度和生物學(xué)活性,基于抗體的免疫學(xué)特性,我們采用抗原抗體分析中常用的酶聯(lián)免疫夾心反應(yīng)的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)(圖2).

這一評(píng)價(jià)方法可以定量地反映硅片上的抗體固定效果,即硅片表面具有生物活性的抗體分布情況.并且可以移植到其他標(biāo)志物(如熒光標(biāo)記或磁標(biāo)記)的分析檢測(cè)中.具體的操作步驟如下.

1.5.1 抗原抗體的免疫夾心反應(yīng)

將不同固定方法修飾的抗體芯片(各5片以上)清洗干凈后,置于微反應(yīng)池中,然后加入不同濃度的CEA抗原(200 μL,45%(φ)小牛血清稀釋),置于氣浴恒溫振蕩器上37℃溫育1 h,反應(yīng)完成后分別取出用0.1%(φ)PBST清洗3遍.再將硅片放入新的微反應(yīng)池中,接著再加入CEA標(biāo)記抗體-HRP(4 μg· mL-1,200 μL,15 mg·mL-1BSA稀釋),置于37℃溫育1 h,最后分別取出用0.1%(φ)PBST清洗3遍.

1.5.2 顯色反應(yīng)

將免疫反應(yīng)后的芯片置于新的微反應(yīng)池中,加入TMB顯色液各150 μL,37℃溫育15 min后,將顯色反應(yīng)后的溶液移取到96孔酶聯(lián)板中,再分別加入終止液(2 mol·L-1H2SO4)各50 μL,最后用酶標(biāo)儀進(jìn)行比色測(cè)試,比色測(cè)試應(yīng)在加入終止液后5 min內(nèi)完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 直接吸附抗體

蛋白質(zhì)之間的吸附作用主要來(lái)自于疏水作用、靜電作用、范德華力作用、路易斯酸堿力作用以及構(gòu)象變化和表面附近受限的側(cè)向擴(kuò)散[13].通過(guò)物理吸附的方式直接固定抗體是最經(jīng)典的抗體固定方式,常用的方法是將抗體吸附到疏水性表面(如聚苯乙烯(PS)表面)或帶有高密度電荷的表面(如多聚賴(lài)氨酸(PLL)包被的玻片),這種方法具有價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn).圖3是對(duì)兩種最常用的物理吸附固定抗體方法的測(cè)試結(jié)果,從圖中可以看出,在PS表面隨著CEA抗原濃度的增加呈現(xiàn)出較好的線性相關(guān),這說(shuō)明在PS表面通過(guò)疏水相互作用可以固定上大量具有生物活性的CEA抗體,但是卻具有較高的非特異性吸附.而在PLL表面則幾乎沒(méi)有免疫響應(yīng),這說(shuō)明通過(guò)靜電相互作用并未能有效固定CEA抗體.我們認(rèn)為這可能是因?yàn)槎趸璞砻嬷饕獮橐粚与娭行缘墓枇u基或硅氧橋鍵,很難吸附上電荷富集的PLL,因而沒(méi)有能夠形成一層富集電荷的表面來(lái)用于進(jìn)一步吸附CEA抗體.由于吸附是競(jìng)爭(zhēng)的和可逆的,因此在后續(xù)的免疫反應(yīng)和多次沖洗過(guò)程中,可能造成硅片表面抗體的脫落,進(jìn)而影響其結(jié)果的穩(wěn)定性和一致性,并且通過(guò)物理吸附固定的抗體通常呈現(xiàn)區(qū)域聚集狀,也具有較高的非特異性吸附,這在高靈敏度的分析檢測(cè)中是個(gè)很?chē)?yán)重的問(wèn)題,因而其應(yīng)用范圍有限.

2.2 直接共價(jià)連接抗體

相對(duì)于物理吸附法固定抗體,通過(guò)氨基、羧基或巰基共價(jià)連接的方式可以使得抗體的固定更加穩(wěn)定.通常的方法是先用硅烷試劑(如APTES、MPTS或GPTS等)在硅片表面衍生出具有化學(xué)活性的功能團(tuán)(如氨基、巰基、羧基、環(huán)氧基等),然后再通過(guò)各種偶聯(lián)試劑(如戊二醛、SMCC、EDC/NHS等)將抗體固定到硅片表面.由于固定效率依賴(lài)于交聯(lián)基團(tuán)的數(shù)量和偶聯(lián)反應(yīng)的效率,抗體種類(lèi)的變化和反應(yīng)條件的波動(dòng)常常會(huì)帶來(lái)較大影響,因而通過(guò)直接共價(jià)連接的方式固定抗體的密度常常較低.圖4是常用的幾種直接共價(jià)連接的方式固定抗體的酶聯(lián)測(cè)試結(jié)果.從圖中可以看出,利用APTES進(jìn)行硅烷化,戊二醛作為偶聯(lián)試劑具有最好的固定效果,但是仍然具有較高的非特異性吸附.這可能是因?yàn)锳PTES化的硅片表面形成的是一種致密的毛刷結(jié)構(gòu),因而具有一定的疏水性,可能帶來(lái)較高的非特異性吸附.利用SMCC偶聯(lián)巰基和氨基比通過(guò)EDC/NHS活化羧基連接氨基的偶聯(lián)效果要弱些,這可能是因?yàn)镋DC/NHS和SMCC較為活潑,在偶聯(lián)過(guò)程中容易失活或逆平衡解離所致.而環(huán)氧表面對(duì)氨基的直接偶聯(lián)效果不太好可能是因?yàn)榄h(huán)氧基團(tuán)與氨基的反應(yīng)在中性條件下較慢所致[35],值得指出的是,環(huán)氧基團(tuán)偶聯(lián)氨基開(kāi)環(huán)之后會(huì)生成一個(gè)電中性的親水羥基,有助于減弱非特異性吸附.

2.3 加入不同的間隔臂共價(jià)連接抗體

為了提高共價(jià)連接固定抗體的效率,考慮在固定抗體之前先在硅片表面引入一層大分子間隔臂,有文獻(xiàn)報(bào)道大分子間隔臂的引入可以有效地改善固相表面的親水性和生物兼容性,改善抗原抗體免疫結(jié)合時(shí)的空間位阻[36-37],提高硅片表面抗體的免疫反應(yīng)效率.我們比較了常用的蛋白質(zhì)分子(BSA和IgG)和多氨基聚合物(PLL和殼聚糖),偶聯(lián)試劑為戊二醛或SMCC,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示.

從圖5中可以很明顯地看出,多氨基聚合物的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于蛋白質(zhì)分子.這可能是因?yàn)槎喟被酆衔镏泻懈嗟目梢詤⑴c反應(yīng)的活性氨基,因而具有更高的偶聯(lián)反應(yīng)效率.多聚賴(lài)氨酸(PLL)和殼聚糖(chitosan)均具有很好的固定效果,其中多聚賴(lài)氨酸表面具有更低的非特異性吸附,這可能是因?yàn)槎嗑圪?lài)氨酸分子內(nèi)含有許多親水功能團(tuán),可以極大地增強(qiáng)芯片表面的親水性,從而起到了降低非特異性吸附的作用.

2.4 利用生物親和作用固定抗體

由于參加反應(yīng)的氨基、羧基或巰基基團(tuán)與偶聯(lián)試劑的共價(jià)反應(yīng)是難以控制的,如果交聯(lián)發(fā)生在蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)上可能會(huì)顯著降低蛋白質(zhì)的生物活性.為了進(jìn)一步提高硅片表面固定抗體的生物活性,并且為了適應(yīng)各種不同抗體的固定,我們考慮利用生物親和作用的方式固定抗體.最常用的生物親和作用有蛋白A/G-IgG抗體(Fc段)親和作用和Avidin-Biotin親和作用[17,31,38].在本實(shí)驗(yàn)中,我們分別將蛋白A、蛋白G、Avidin分子共價(jià)固定到硅片表面,再利用生物親和作用將CEA抗體(IgG抗體)或CEA抗體-Biotin固定到硅片表面,然后分別進(jìn)行酶聯(lián)免疫測(cè)試評(píng)價(jià)抗體固定效果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示.

從圖6中可以看出,通過(guò)生物親和作用可以有效地固定抗體,并且具有較高的生物活性,這可能是因?yàn)榈鞍譇、蛋白G或Avidin分子承受了固相表面的微環(huán)境變化和共價(jià)交聯(lián)的化學(xué)變化而非抗體本身,并且借助生物親和作用可以實(shí)現(xiàn)抗體的定向固定,因而最大程度地保留了抗體特異結(jié)合位點(diǎn)的生物活性和空間取向[10,17,39-41].同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),這種利用生物親和作用固定抗體的方法具有較高的非特異性吸附.這可能是因?yàn)檫@些生物親和表面不能有效地封閉造成的.特別是Avidin表面,由于固定的是生物素化的包被抗體,而生物素是電子富集的小分子,在抗體上的標(biāo)記通常是隨機(jī)并且大量的(一個(gè)抗體分子上通常連接有幾個(gè)到十幾個(gè)Biotin小分子),因而對(duì)后續(xù)的CEA標(biāo)記抗體-HRP分子具有較強(qiáng)的靜電吸附作用,解決這個(gè)問(wèn)題的方法之一是對(duì)包被抗體進(jìn)行位點(diǎn)特異性生物素化[42].而共價(jià)連接兩層聚賴(lài)氨酸(PLL)的表面可以進(jìn)一步提高固定效率和降低非特異性吸附.

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過(guò)共價(jià)連接固定抗體可以得到比通過(guò)物理吸附更好的固定效果,各種偶聯(lián)反應(yīng)中戊二醛對(duì)氨基的偶聯(lián)效率最高.引入含有多功能團(tuán)的聚合物分子可以提高偶聯(lián)固定的反應(yīng)效率,多聚賴(lài)氨酸和殼聚糖是很好的氨基放大試劑,可以用于氨基偶聯(lián)試劑(如戊二醛)的增強(qiáng)固定,減弱非特異性吸附,并且可以增加抗體分子與平面硅片之間的距離,增加固定抗體的柔韌度,改善空間取向,從而提高硅片表面固定抗體的生物活性.對(duì)于IgG類(lèi)型的某些抗體,可以利用蛋白A或蛋白G的親和作用進(jìn)行定向固定,最大限度地保持固定抗體的生物活性.

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Effect of Surface Chemical Properties of a Silicon Chip on Antibody Immobilization

ZHOU Wen-Wen1,2LIAN Jie1,2HU Ke-Jia1,2GAO Yun-Hua1,*XU Bai1,*
(1Key Laboratory of Photochemical Conversion and Optoelectronic Materials,Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China;2Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049,P.R.China)

The key to constructing a protein microarray is the stable immobilization of proteins and the retention of their biological activities.In this study,immobilization of the carcinoembryonic antigen(CEA)antibody onto a silicon dioxide surface was investigated by physical adsorption,direct chemical covalent conjugation,spacer-added chemical covalent conjugation,and biological affinity interactions.Based on the specific antibody-antigen interactions,the sandwich reaction,enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was chosen to evaluate various immobilization strategies.The most efficient immobilization strategy was with glutaraldehyde as a coupling reagent between the CEA antibody and the amino surface.The attachment of a spacer-arm comprising poly-L-lysine significantly improved the immobilization efficiency and simultaneously decreased nonspecific adsorption.High immobilization efficiency and stronger nonspecific adsorption were also observed when the CEA antibody was immobilized by bioaffinity interactions.

Protein microarray;Antibody immobilization;Sandwich reaction;Enzyme-linked immunosorbent assay;Amino surface;Glutaraldehyde;Poly-L-lysine

O647

Received:April 22,2010;Revised:July 9,2010;Published on Web:September 3,2010.

*Corresponding authors.GAO Yun-Hua,Email:yhgao@mail.ipc.ac.cn;Tel:+86-10-82543581.XU Bai,Email:nanobioic@gmail.com.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20975106),Funds of the Chinese Academy of Sciences for Key

Topics in Innovation Engineering(KJCX2-YW-M15)and Important National Science&Technology Specific Projects,China(2008ZX08012-001).

國(guó)家自然科學(xué)基金(20975106),中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目(KJCX2-YW-M15)及國(guó)家重大專(zhuān)項(xiàng)(2008ZX08012-001)資助

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