一株拮抗儲(chǔ)糧真菌的細(xì)菌菌株鑒定和初步研究

代巖石吳子丹伍松陵王松雪宋 慧孫長坡

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1,吉林 130118)

(國家糧食局科學(xué)研究院2,北京 100037)

一株拮抗儲(chǔ)糧真菌的細(xì)菌菌株鑒定和初步研究

代巖石1,2吳子丹2伍松陵2王松雪2宋 慧1孫長坡2

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1,吉林 130118)

(國家糧食局科學(xué)研究院2,北京 100037)

在糧庫倉儲(chǔ)玉米中分離到一株強(qiáng)烈拮抗儲(chǔ)糧真菌的細(xì)菌,初步研究表明該菌株對(duì)儲(chǔ)糧中的主要產(chǎn)毒真菌如黃曲霉菌、赭曲霉菌、三線鐮刀菌等都具有強(qiáng)烈的拮抗作用。利用生理、生化等常規(guī)技術(shù)并結(jié)合16S rDNA分子鑒定方法,最終確定該菌株為一株解淀粉芽孢桿菌,命名為 Bacillus amyloliquefaciens ASAG1。進(jìn)一步確定了ASAG1菌株的搖瓶發(fā)酵最適培養(yǎng)基、發(fā)酵條件,并對(duì)發(fā)酵液中,活性抑菌物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行了初步研究和純化。該研究的開展為進(jìn)一步明確活性抑菌組分提供了借鑒,同時(shí)也為利用生物技術(shù)防控糧食中的產(chǎn)毒真菌提供了一個(gè)新思路。

儲(chǔ)糧 產(chǎn)毒真菌 拮抗 解淀粉芽孢桿菌 活性物質(zhì)

谷物是人們攝取營養(yǎng)、賴以生存的能量來源,是平衡膳食金字塔中比例最大、最為重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。因發(fā)霉、害蟲危害導(dǎo)致的儲(chǔ)糧品質(zhì)劣變和損失嚴(yán)重危害著我國儲(chǔ)糧安全。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì),每年約有 25%糧食因真菌毒素污染影響食用[2-3]。目前發(fā)現(xiàn)危害糧食儲(chǔ)藏的真菌有 150多種,并可產(chǎn)生 200多種真菌毒素[4]。人體攝入這些毒素之后能夠?qū)е聡I吐、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、多種原發(fā)性癌癥、甚至急性中毒死亡等等[4]。因此防止糧食霉變是保持糧食品質(zhì)的重要方法之一。

目前所用的防霉方法主要是通過降低儲(chǔ)藏水分、溫度等物理作用處理糧食及其制品以防止霉菌生長,或通過添加化學(xué)防霉劑的方法控制儲(chǔ)糧及糧食產(chǎn)品霉變[5-6]。但是這些方法具有破壞營養(yǎng)、效果持續(xù)時(shí)間短、防霉不徹底和成本高等缺陷,從而造成實(shí)際防控效果不理想,另外有些化學(xué)防霉劑,本身具有一定毒性,使用不當(dāng)反而會(huì)影響食用安全和污染環(huán)境。而利用一些有著抗真菌作用又對(duì)人體無害的微生物防霉則有成本低、增值快、作用效果持久、安全高效、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。因此研究、開發(fā)生物防霉和利用微生物及其代謝產(chǎn)物防霉等技術(shù),是提高防霉效率、減少營養(yǎng)損失、降低儲(chǔ)存成本的好方法。另外某些微生物的代謝過程還可以降解糧食和飼料中的不容易被機(jī)體消化吸收的大分子,使其降解成可以被機(jī)體直接吸收利用的小分子,從而在提高糧食利用率的同時(shí),并提升了產(chǎn)品價(jià)值。

本研究對(duì)從儲(chǔ)糧中分離得到的一株拮抗產(chǎn)毒真菌的解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行了菌株鑒定,并初步驗(yàn)證該菌株具有較好拮抗產(chǎn)毒真菌作用和使用安全性。同時(shí)對(duì)該菌株的培養(yǎng)條件以及抑菌譜進(jìn)行了研究。在初步分析抑菌活性物質(zhì)特點(diǎn)的前提下,從發(fā)酵液中粗提濃縮了抑菌活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

從儲(chǔ)備糧庫的玉米中分離篩選到具有強(qiáng)烈抑制真菌作用的一株細(xì)菌,并經(jīng)純化、培養(yǎng)作為本研究目的菌株。本研究中用于作為指示菌及抗菌譜研究的儲(chǔ)糧主要有害真菌有黑曲霉菌 (Aspergillus.nigerCG2 MCC3.4463)、黃曲霉菌 (Aspergillus.flavusCG MCC 3.4410)、赭曲霉菌 (Aspergillus.ochraceusCG MCC 3.4520)、灰綠曲霉菌 (Aspergillus.glaucusCG MCC 3.3980)、煙曲霉菌 (Aspergillus.fum igatusCG MCC 3.3552)、赤 曲 霉 菌 (Aspergillus. ruberCG MCC 3.3956)、黃綠青霉菌 (Penicillium.citreo-virideCG M2 CC3.4038)、疣孢青霉菌 (Penicillium.verruculosum CG MCC3.4297)、半裸鐮刀菌 (Fusarium.sem itectum CG MCC3.0719)、尖孢鐮刀菌 (Fusarium.oxysporumCG MCC3.2830)、三線鐮刀菌 (Fusarium.tricinetum CG MCC3.4731),其中黃曲霉菌、赭曲霉菌、三線鐮刀菌為產(chǎn)毒株,均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心;炭黑曲霉菌 (Aspergillus.carbonarius),由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)梁志宏老師贈(zèng)予;蘇云金芽孢桿菌 (B acillus. thuringiensisHD73)、蠟樣芽孢桿菌 (B acillus.cereus 14579)、蠟樣芽孢桿菌 (B acillus.cereus10987)、枯草芽孢桿菌 (B acillus.Subtilis168)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

用于搖瓶發(fā)酵的 4號(hào)液體培養(yǎng)基,做抗菌譜試驗(yàn)的 4號(hào)固體培養(yǎng)基,做抑菌試驗(yàn)用培養(yǎng)基有 PDA (馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)、察氏培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基和濃糖察氏培養(yǎng)基。

1.1.3 試驗(yàn)主要儀器

溫度梯度 PCR儀:AB I公司;恒溫混勻器:eppen2 dorf公司;5810R離心機(jī):eppendorf公司;自動(dòng)高壓滅菌器:H IRAYAMA公司;全溫振蕩培養(yǎng)箱:河北太倉科學(xué)儀器有限公司;IX71顯微鏡:奧林巴斯公司。

1.1.4 試驗(yàn)主要試劑與耗材

無菌微孔濾膜(濾徑為 0.2μm,除菌用):PALL公司;核酸回收試劑盒:大連 TaKaRa公司;血瓊脂培養(yǎng)基:友康基業(yè)生物科技 (北京)有限公司;生化試劑:主要購置于 Sigma公司、北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;其他化學(xué)試劑(均為分析純):北京奧博星生物技術(shù)公司和北京化學(xué)試劑廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離

①把糧庫的儲(chǔ)藏玉米 25 g加入到 225 mL無菌水中,振蕩搖洗 30 min,樣液做梯度稀釋到 103～104倍,接 PDA培養(yǎng)基,其配方為:馬鈴薯 200 g/L、葡萄糖 20 g/L、瓊脂 20 g/L,自然 pH,48 h開始觀察,每天 1次共觀察 7 d。②觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿中有拮抗真菌的菌落,挑取該菌落,以劃線方式接 PDA培養(yǎng)基, 48 h后觀察。③挑取形態(tài)不同的各個(gè)菌落在 PDA培養(yǎng)基上與不同的儲(chǔ)糧有害真菌做對(duì)峙試驗(yàn)。④挑選有較強(qiáng)拮抗現(xiàn)象的菌落,重復(fù)步驟②,若平皿上只生長一種菌落,重復(fù)步驟③,有拮抗現(xiàn)象,則該拮抗菌株被分離純化成功。若平皿上生長有多種菌落,則反復(fù)重復(fù)步驟③、④直至拮抗菌株被分離純化出來。若單一菌落對(duì)真菌無拮抗作用則需返回步驟③,重復(fù)以上各步驟,直至拮抗菌株被分離純化。

1.2.2 菌株對(duì)產(chǎn)毒真菌的拮抗作用初步驗(yàn)證

將黃曲霉菌、赭曲霉菌、三線鐮刀菌接入到1 000 g經(jīng)輻照滅菌的高水份玉米中,28℃、相對(duì)濕度70%培養(yǎng) 90 d,分別取 25 g樣品,粉碎后檢測(cè)黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮。黃曲霉毒素B1檢測(cè)方法參照 GB/T 5009.22—2008、赭曲霉毒素檢測(cè)方法參照 GB/T 5009.96—2008、玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法參照 GB/T 5009.209—2008。用以上經(jīng)驗(yàn)證產(chǎn)毒的黃曲霉菌、赭曲霉菌、三線鐮刀菌分別與篩選出來的有拮抗作用的菌株做對(duì)峙試驗(yàn),以測(cè)定其對(duì)產(chǎn)毒真菌的拮抗作用。

1.2.3 菌株的鑒定

①革蘭氏染色;②芽孢染色;③分解淀粉試驗(yàn):將該菌株與對(duì)照菌枯草芽孢桿菌一起接在加入 2%可溶性淀粉的 PDA培養(yǎng)基上,31℃培養(yǎng) 48 h后在培養(yǎng)基表面均勻滴加 1%碘酒精溶液,再放入培養(yǎng)箱, 30 min后觀察;④測(cè)定該菌株生長情況,檢測(cè)在 600 nm波長的吸光值,繪制菌株生長曲線,觀察產(chǎn)生芽孢情況;⑤16S r DNA鑒定:選擇對(duì)數(shù)生長期的菌液作為提取樣本,提取基因組DNA,對(duì) 16S rDNA目的片斷 PCR進(jìn)行擴(kuò)增[7]。

引物序列:

Bs16sR:5′-TGGAGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′

Bs16sF:5′-AAG GAG GTGATC CAG CCG CAC CT-3′

PCR反應(yīng)體系 (50μL):純水 30μL,10×buffer 5μL,dNTP4μL,lmol/L的MgCl2 3μL,上下游引物各1μL,模板DNA 4μL,Taq DNA聚合酶 1μL。

PCR反應(yīng)條件:①94℃預(yù)變性 5 min;②94℃變性 30 s、57℃退火 40 s、72℃延伸 90 s,31個(gè)循環(huán);③72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物回收插入 PMD-18T載體后由上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。

序列輸入 GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì),選擇同源性高的序列使用 Clustal W→TreeView軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]。

1.2.4 菌株安全性初步評(píng)價(jià)

以產(chǎn)生外毒素的蠟樣芽孢桿菌 14579、蠟樣芽孢桿菌 10987、蘇云金芽孢桿菌為對(duì)照,將目的菌株與三種對(duì)照菌株接在血瓊脂培養(yǎng)基上,31℃培養(yǎng) 48 h觀察溶血現(xiàn)象[9]。

1.2.5 培養(yǎng)基篩選

中所用的 4種用于目的芽孢桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基分別命名為 1號(hào)培養(yǎng)基[10],2號(hào)培養(yǎng)基[11],3號(hào)培養(yǎng)基[12],4號(hào)培養(yǎng)基[13]。經(jīng)以上 4種培養(yǎng)基發(fā)酵后的除菌發(fā)酵液用牛津杯定量法比較抑菌效果,從中選出一種最適培養(yǎng)基。同時(shí),從儲(chǔ)糧主要有害真菌中篩選出一種被抑制作用明顯、對(duì)人體危害小、生長快速、便于觀察的菌株作為抑制試驗(yàn)指示菌。

1.2.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化

以選定的培養(yǎng)基為基礎(chǔ),搖床培養(yǎng),200 r/min。時(shí)間條件優(yōu)化:比較培養(yǎng) 8、12、16、24、30、36、48、60、72、96 h的發(fā)酵液抑菌作用。pH條件優(yōu)化:調(diào)整培養(yǎng)基 pH值,分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0培養(yǎng)72 h后比較抑菌作用。溫度條件優(yōu)化:比較 25、27、29、31、33、35、37℃培養(yǎng) 72 h的發(fā)酵液抑菌作用。

1.2.7 菌株抑菌譜試驗(yàn)

采用對(duì)峙試驗(yàn)方法[14],ASAG1菌株與 12種常見儲(chǔ)糧有害真菌在 4號(hào)培養(yǎng)基上做對(duì)峙試驗(yàn)。

1.2.8 除菌發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)

將ASAG1菌株發(fā)酵液以 12 000 r/min離心 10 min,上清液用 0.2μm無菌微孔濾膜過濾除菌后,采用牛津杯定量法[15]做抑制試驗(yàn),測(cè)量抑菌圈直徑大小,以確定該菌株對(duì) 12種常見儲(chǔ)糧有害真菌的抑菌效果。其中黑曲霉菌、黃曲霉菌、煙曲霉菌、炭黑曲霉菌、疣孢青霉菌、赭曲霉菌、黃綠青霉菌使用察氏培養(yǎng)基,三線鐮刀菌、半裸鐮刀菌、尖孢鐮刀菌使用PDA培養(yǎng)基,灰綠曲霉菌使用高鹽察氏培養(yǎng)基,赤曲霉菌使用濃糖察氏培養(yǎng)基做抑菌試驗(yàn)。

表1 培養(yǎng)基配方/g/L

1.2.9 活性抑菌物質(zhì)性質(zhì)初步研究

以培養(yǎng) 72 h的發(fā)酵液為基礎(chǔ)。①用 1 mol/L鹽酸和 1 mol/L氫氧化鈉調(diào)整發(fā)酵液 pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0,觀察發(fā)酵液有無沉淀及比較各 pH值時(shí)發(fā)酵液的抑菌作用。②發(fā)酵液以不同溫度、持續(xù)時(shí)間加熱,比較經(jīng) 70℃300 min、100℃15 min、100℃30 min、100℃60 min、100℃120 min、121℃20 min處理后的發(fā)酵液抑菌作用。③將 1 mL發(fā)酵液與乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、異丙醇、二氯甲烷等常用有機(jī)溶劑等體積混合后密閉放置 24 h,氮吹,除去有機(jī)溶劑,用純水定容至 1 mL,做抑菌試驗(yàn)比較其抑菌作用。

1.2.10 活性物質(zhì)的初步提取

利用發(fā)酵液在不同pH值時(shí)產(chǎn)生沉淀的性質(zhì),用 1 mol/L氫氧化鈉調(diào)整發(fā)酵液 pH值至11.0,5 000 r/min離心5min,去除沉淀,再用1mol/L鹽酸調(diào)pH值至3. 0,12 000 r/min離心 10 min,棄掉上清液,沉淀加少量純水,再調(diào) pH值到 7.0溶解,再加純水定容為原體積的 1/100,再取 100倍濃縮粗提液 100μL加純水定容至10 mL,混勻,與發(fā)酵液原液做等量抑菌試驗(yàn),比較二者活性大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離

在 PDA培養(yǎng)基上挑選有強(qiáng)烈拮抗儲(chǔ)糧真菌作用的菌株,經(jīng)反復(fù)純化培養(yǎng)及拮抗作用測(cè)試,篩選出一株細(xì)菌,命名為ASAG1菌株。ASAG1菌株為革蘭氏陽性短桿菌。芽孢染色鏡檢如圖 1所示,可產(chǎn)生大量芽孢。

圖 1 B.amyloliquefaciensASAG1菌株芽孢染色鏡相

2.2 菌株鑒定

分解淀粉試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,可以看出,該菌的分解淀粉能力要比對(duì)照菌(枯草芽孢桿菌)強(qiáng)得多。

圖 2 B.amyloliquefaciensASAG1菌株分解淀粉試驗(yàn)

2.3 16S rDNA序列測(cè)定及分析

由圖3可以看出,菌株ASAG1的16S r DNA核苷酸片段大小為 1.5 Kb左右,測(cè)定結(jié)果為 1 468 bp。將上述序列輸入 www.NCB I.Nih.nih.gov./blast.與Genbank數(shù)據(jù)庫的序列比進(jìn)行同源性分析,并利用Clusta X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖 4。

綜合以上分析可將該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌 (B acillus am yloliquefaciens)。并將該菌的 16S r D2 NA序列提交到 NCB I Genbank中登錄注冊(cè),序列接受號(hào)為:FJ597542。

2.4 外毒素產(chǎn)生分析

安全性初步評(píng)價(jià)試驗(yàn)中,如圖 5所示,可以看出,三株對(duì)照菌蠟樣芽孢桿菌 14579、蠟樣芽孢桿菌10987、蘇云金芽孢桿菌菌落周圍均有明顯的溶血環(huán),而ASAG1菌株則無溶血現(xiàn)象。因此,初步驗(yàn)證了ASAG1菌株不產(chǎn)外毒素,使用安全。

圖 5 B.amyloliquefaciensASAG1菌株產(chǎn)外毒素測(cè)定結(jié)果

2.5 儲(chǔ)糧真菌產(chǎn)生真菌毒素的鑒定及 ASAG1菌株對(duì)真菌的拮抗效果

將ASAG1菌株與在糧食中生長、經(jīng)檢驗(yàn)產(chǎn)毒(如圖 6至圖 8所示)的黃曲霉菌、赭曲霉菌、三線鐮刀菌做對(duì)峙試驗(yàn),結(jié)果如圖 9所示,其對(duì)這三株產(chǎn)毒真菌有明顯的拮抗作用。

2.6 培養(yǎng)基篩選與培養(yǎng)條件優(yōu)化

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),活性物質(zhì)對(duì)黑曲霉菌的抑制作用明顯,且黑曲霉菌對(duì)人體相對(duì)安全、容易操作、生長速度快、24～48 h就可以觀察結(jié)果,適合作為試驗(yàn)指示菌使用,以下的試驗(yàn)將以此為基礎(chǔ)展開。

ASAG1菌株在四種培養(yǎng)基中經(jīng)搖床培養(yǎng) 200 r/ min,31℃,72 h后,除菌發(fā)酵液對(duì)黑曲霉菌的抑制作用在圖 10中可以看出,4號(hào)培養(yǎng)基的抑制作用最明顯,抑菌圈直徑最大為 23 mm,3號(hào)培養(yǎng)基的抑菌圈為16 mm,2號(hào)培養(yǎng)基的抑菌圈為 10 mm,1號(hào)培養(yǎng)基的抑菌圈為 8 mm。因此選擇 4號(hào)培養(yǎng)基作為ASAG1菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的最適培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果說明,糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖這 4種碳源中,以乳糖作為碳源最有利于 ASAG1菌株發(fā)酵產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì),牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨中,以蛋白胨作為氮源最有利于 ASAG1菌株發(fā)酵產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)。無機(jī)氮源中,硝酸鈉效果要好于硫酸銨。4號(hào)培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯 100 g/L、乳糖 40 g/L、蛋白胨15 g/L、硝酸鈉 0.5 g/L、7水合硫酸鎂 4 g/L,pH值7.0(4號(hào)培養(yǎng)基加入 20 g/L瓊脂即為 4號(hào)固體培養(yǎng)基)。

圖 10 B.amyloliquefaciensASAG1菌株在 4種不同培養(yǎng)基中產(chǎn)生活性物質(zhì)的能力

ASAG1菌株搖瓶培養(yǎng),24 h開始有抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生,隨時(shí)間延長,抑菌活性物質(zhì)的含量逐漸增加,如表 2所示,到 48 h抑菌圈直徑達(dá)到 22 mm,之后抑菌圈直徑?jīng)]有明顯增大。培養(yǎng)基的 pH值在5.0～11.0之間,均可以產(chǎn)生活性物質(zhì),但與 pH值7.0時(shí)的抑菌圈相比較小,如表 3所示,這表明, ASAG1菌株產(chǎn)生的活性抑菌物質(zhì)的 pH值適應(yīng)范圍較寬,最適 pH值為 7.0。ASAG1菌株在不同溫度下培養(yǎng)產(chǎn)生的活性物質(zhì)的量差異不大,如表 4所示, 31℃培養(yǎng)時(shí)抑菌圈的直徑最大為 23 mm,25℃和37℃培養(yǎng)時(shí)抑菌圈直徑分別為20 mm和 21 mm。這說明ASAG1菌株適應(yīng)溫度范圍較寬。因此,培養(yǎng)基pH值 7.0,31℃,培養(yǎng) 48～72 h,是ASAG1菌株的最佳培養(yǎng)條件。

表2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的影響

表3 培養(yǎng)基pH值對(duì)抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的影響

表4 培養(yǎng)溫度抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的影響

2.7 菌株與除菌發(fā)酵液抑菌效果

ASAG1菌株與 12種常見儲(chǔ)糧有害真菌,在 4號(hào)固體培養(yǎng)基上做對(duì)峙試驗(yàn),結(jié)果表明:ASAG1菌株對(duì)黑曲霉菌、黃曲霉菌、煙曲霉菌、三線鐮刀菌、炭黑曲霉菌、疣孢青霉菌、赭曲霉菌、半裸鐮刀菌、尖孢鐮刀菌有明顯的拮抗作用。而黃綠青霉菌、灰綠曲霉菌、赤曲霉菌在 4號(hào)固體培養(yǎng)基上不能生長,無法觀察拮抗作用。

牛津杯定量法對(duì)除菌發(fā)酵液的抑菌試驗(yàn)結(jié)果,如表 5所示,ASAG1菌株發(fā)酵液對(duì)以上 12種真菌都有明顯的抑制作用。

表5 除菌發(fā)酵液對(duì) 12種儲(chǔ)糧有害真菌抑制作用

2.8 活性物質(zhì)的性質(zhì)探索與初步提取

向ASAG1菌株發(fā)酵液中加鹽酸調(diào) pH值到 5.1時(shí),發(fā)酵液開始產(chǎn)生沉淀,上清液有活性;繼續(xù)加鹽酸,pH值到 4.0時(shí),上清液活性消失,當(dāng)發(fā)酵液 pH值為 3.0時(shí),沉淀量最大。加氫氧化鈉溶液調(diào)發(fā)酵液 pH值到 9.1時(shí),發(fā)酵液開始產(chǎn)生沉淀,上清液有活性;繼續(xù)加氫氧化鈉,pH值為 11.2時(shí),沉淀最多,上清液有活性,pH值超過 12.0以后活性快速下降,直至消失。圖 11所示為不同 pH值時(shí),上清液抑菌直徑的變化。

圖11 pH值對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)受溫度影響非常小,在100℃以內(nèi)長時(shí)間加熱對(duì)活性幾乎沒有影響,120℃時(shí)對(duì)活性有較小的影響,這說明該菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)具有很好的高溫穩(wěn)定性。

常用有機(jī)溶劑對(duì)發(fā)酵液抑菌活性無影響。

2.9 活性物質(zhì)粗提

根據(jù)發(fā)酵液在不同 pH值時(shí)表現(xiàn)出來的性質(zhì),調(diào)整 pH值,去除無活性沉淀和上清液,回收有活性沉淀,最后得到濃縮粗提液。由于最后定容使用純水溶解沉淀,所以,原來培養(yǎng)基中的鹽和雜質(zhì)也基本上除去。定容為原體積的 1/100,得到 100倍的濃縮粗提液。采用此種方法得到的粗提液 100倍稀釋后做抑菌試驗(yàn),抑菌圈直徑為 20 mm,與原液相比較活性損失不明顯,這說明活性物質(zhì)在整個(gè)處理過程中沒有大量損失和發(fā)生性質(zhì)、結(jié)構(gòu)改變。

3 討論與結(jié)論

在本研究中,一株從儲(chǔ)糧中分離得到的解淀粉芽孢桿菌ASAG1,經(jīng)初步驗(yàn)證對(duì)儲(chǔ)糧中的主要產(chǎn)毒真菌,黃曲霉菌、赭曲霉菌、三線鐮刀菌都有很好的拮抗作用,這說明其生長過程或者代謝產(chǎn)物對(duì)以上三種真菌有抑制作用。之后的安全性試驗(yàn)中, ASAG1菌株不產(chǎn)生對(duì)人體、動(dòng)物有害的細(xì)菌外毒素,初步鑒定了其使用安全性。在以上兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步對(duì) ASAG1菌株的培養(yǎng)條件、抑菌活性以及活性物質(zhì)的粗提展開了細(xì)致的研究。

通過優(yōu)化 ASAG1菌株培養(yǎng)條件的研究發(fā)現(xiàn), ASAG1菌株在較寬的溫度、pH值范圍內(nèi)都可以產(chǎn)生大量的抑菌活性物質(zhì),這說明該菌株適應(yīng)自然環(huán)境能力強(qiáng)。另外,ASAG1菌株對(duì)儲(chǔ)糧有害真菌的強(qiáng)烈抑制作用,保證了該菌株在儲(chǔ)糧及糧食制品防霉方面將有很好的應(yīng)用效果。

在ASAG1菌株的抑菌活性研究中,采用對(duì)峙試驗(yàn)證明,ASAG1菌株在生長過程中對(duì)黑曲霉菌、黃曲霉菌等多種可以產(chǎn)生真菌毒素的儲(chǔ)糧真菌均具有很好的抑制作用。這說明ASAG1菌株具有寬廣的抗菌譜。本研究結(jié)果還表明,ASAG1菌株能產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì),并且活性物質(zhì)可分泌到菌體外部,并溶解在培養(yǎng)基中,有利于提取純化。

研究表明,酸堿作用可以使ASAG1菌株發(fā)酵液中活性物質(zhì)沉淀或溶解,調(diào)整 pH值到 7.0左右時(shí)活性仍可恢復(fù)。利用這一特性調(diào)整 pH值,可得到去除大部分雜質(zhì)和鹽的濃縮活性物質(zhì)組份。在試驗(yàn)中,活性物質(zhì)還表現(xiàn)出耐高溫、與常用有機(jī)溶劑混合后性質(zhì)不發(fā)生變化等特點(diǎn)。在下一步對(duì)活性組份分離純化的試驗(yàn)中,我們就可以利用活性物質(zhì)耐有機(jī)溶劑的性質(zhì),使用有機(jī)溶劑萃取、樹脂吸附、液相色譜等方法純化、制備活性組分;再利用活性物質(zhì)耐高溫的性質(zhì),使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空濃縮等方法進(jìn)一步提純活性組分。

隨著傳統(tǒng)農(nóng)藥、殺蟲劑對(duì)環(huán)境破壞問題日益被人們關(guān)注[16]和植物病原菌耐藥性增強(qiáng),導(dǎo)致藥效相對(duì)降低等原因凸顯[17],利用生物技術(shù)防治作物病害、殺蟲,成為研究熱點(diǎn)。自 1945年 Johnson等人發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)以來[18],芽孢桿菌因其內(nèi)生芽孢、繁殖能力強(qiáng)、有利于工業(yè)化生產(chǎn)、又是自然界廣泛純?cè)诘姆侵虏【戎T多優(yōu)點(diǎn),被科研工作者熱切關(guān)注[19]。近些年,解淀粉芽孢桿菌的抗菌作用逐漸被人們發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)。從已發(fā)表的文獻(xiàn)中看,研究人員在解淀粉芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)至少兩種以上抗菌活性物質(zhì)[20],并且其抗菌活性非常強(qiáng),性質(zhì)穩(wěn)定,不易失活,表現(xiàn)出很好的研究前景。

志謝:本課題研究過程中受到中國農(nóng)業(yè)大學(xué)梁志宏老師、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所等大力的支持和指導(dǎo),并提出了寶貴的建議,在此表示衷心感謝!

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Identification of a Bacterium Strain with Antagonistic Action to Toxigenic Fungi in Stored Grain

Dai Yanshi1,2Wu Zidan2Wu Songling2Wang Songxue2Song Hui1Sun Changpo2
(Jilin AgriculturalUniversity1,Jilin 130118)
(Academy of State Administration of Grain2,Beijing 100037)

A bacterium strain was isolated from stored corn,which has strong antagonistic action to principal toxigenic fungi such asA.flavus,A.ochraceus,F.tricinetum,etc in stored grain.This bacterial strain was identi2 fied asBacillus amyloliquefaciens by using conventional techniques of physiology and biochemistry combined with the 16SrRNA molecular identification method,nominated Academy of State Administration of Grain 1 and abbreviated ASAG1.The optimum medium and conditions for shaking fermentation ofASAG1 bacterial strain were further deter2 mined,and the nature of the bioactive antagonistic substance in the fer mented liquid were preliminary studied and purified.This study provides a clear reference for further studying the antagonistic components,and provides a new consideration for biological control of toxigenic fungi in stored grain.

stored grain,toxigenic fungi,antagonistic,Bacillus amyloliquefaciens,active substance

Q939.92 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003-0174(2010)10-0088-07

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃(2009BADA0B05)

2009-10-10

代巖石,男,1979年出生,碩士,生物化學(xué)與分子生物學(xué)

孫長坡,男,1975年出生,博士,副研究員,生物工程