響應(yīng)面優(yōu)化營養(yǎng)鹽對甜高粱莖桿汁液發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響

王 敏王 頡孫劍鋒牟建樓

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院1,保定 071001)

(河北衡水學(xué)院生命科學(xué)系2,衡水 053000)

響應(yīng)面優(yōu)化營養(yǎng)鹽對甜高粱莖桿汁液發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響

王 敏1,2王 頡1孫劍鋒1牟建樓1

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院1,保定 071001)

(河北衡水學(xué)院生命科學(xué)系2,衡水 053000)

燃料乙醇作為石油替代產(chǎn)品之一,可緩解能源供應(yīng)的壓力。以甜高粱秸稈為原料,研究營養(yǎng)鹽對發(fā)酵生產(chǎn)乙醇產(chǎn)量的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上,利用 Box-Behnken中心組合設(shè)計響應(yīng)面法對甜高粱莖稈汁液發(fā)酵添加營養(yǎng)鹽(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2對發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響進行了研究。結(jié)果表明,在甜高粱莖稈汁液發(fā)酵過程中,通過響應(yīng)面分析建立添加營養(yǎng)鹽與發(fā)酵液酒精度之間的回歸模型 Y=9.92-0.13X1+0.32 X2-0.23 X3+0.18 X4-0.20X1X2-0.35X1X3-0.70X12-0.66 X22-0.77 X32-0.76 X42可用于生產(chǎn)預(yù)測,最適宜添加量 (NH4)2SO4為 4.61 g/L,MgSO4為 1.64 g/L,KH2PO4為 2.72 g/L,CaCl2為2.82 g/L。在此條件下進行驗證試驗,重復(fù) 3次,酒精度為 9.9%。

Box-Behnken 響應(yīng)面法 甜高粱汁 營養(yǎng)鹽

隨著石油燃料供應(yīng)日趨緊張和環(huán)保呼聲的日益高漲,尋找和發(fā)展替代石油的新能源成為當務(wù)之急。目前世界各國均在開展生物質(zhì)能源的研究工作,主要原料為淀粉質(zhì)原料(如玉米,美國模式)、糖質(zhì)原料(如甘蔗,巴西模式)[1-2]。此外,農(nóng)作物秸稈[3]等木質(zhì)素原料生產(chǎn)燃料乙醇的研究已經(jīng)取得階段性進展。

我國國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)表明,2006年我國石油生產(chǎn)量 18 476.6萬噸,進口量 19 453.0萬噸[4],因此,利用可再生能源作為石油的替代品變得愈加重要。2000年我國開始啟動以玉米陳化糧為原料的燃料乙醇項目,已取得初步成效。但是使用這些原料存在與糧爭地、與人爭糧的問題。因此,必須尋求一種不與糧爭地、不與人爭糧、不與牲畜爭飼料、不與其他產(chǎn)業(yè)爭原料的作物。而甜高粱因符合以上條件而成為較有前途的生物質(zhì)原料之一[5-6]。

甜高粱是一種高生物量和高糖 C4植物,適應(yīng)性較強,抗逆性好,在比較貧瘠的土地上可達萬斤以上,其莖稈含汁量為 60%～80%,汁液的糖錘度為10%～20%,汁液中含有蔗糖、葡萄糖、果糖等糖份。甜高粱莖稈汁液接種酵母發(fā)酵成乙醇,再經(jīng)精餾即可按一定比例混合到汽油中作為汽車燃料,無論是從經(jīng)濟性還是從解決能源、糧食安全的角度看,都具有廣闊的發(fā)展前景。因此利用甜高粱液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇已成為生物質(zhì)能源領(lǐng)域中的重要研究課題之一。目前對甜高粱莖稈汁液液態(tài)發(fā)酵工藝研究報道較多[7-8],而在發(fā)酵過程中添加營養(yǎng)鹽的研究較少,例如張恩銘等[9]在甜高粱莖稈汁液發(fā)酵過程中添加(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2,利用正交試驗確定最適添加量;劉榮厚等[10]應(yīng)用正交試驗確定了在甜高粱莖稈汁液發(fā)酵過程中添加 (NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4的濃度;康利平等[11]確定在發(fā)酵過程中添加尿素、MgSO4、CaCl2等可以提高乙醇產(chǎn)率,而利用響應(yīng)面法優(yōu)化營養(yǎng)鹽對甜高粱莖稈汁液發(fā)酵生成乙醇產(chǎn)率影響的內(nèi)容未見報道。

響應(yīng)面 (response surface methodology,RS M)是一種綜合試驗設(shè)計和數(shù)學(xué)建模,通過局部試驗回歸擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系,從而得出數(shù)學(xué)模型的方法。同時對影響生物產(chǎn)量的各因素水平及其交互作用進行優(yōu)化與評價,因此可快速有效地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件[12]。近年來 RS M方法日益受到重視,已在食品品質(zhì)評價[13]、乳酸生產(chǎn)[14]、新藥研制與開發(fā)[15-17]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

研究采用響應(yīng)面對甜高粱液體發(fā)酵過程添加營養(yǎng)鹽的效果進行考察和評價,確定較優(yōu)的發(fā)酵條件,以備為后續(xù)放大試驗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜高粱:品種四粒美,2008年 10月采于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場;菌種:丹寶利釀酒高活性干酵母,廣東丹寶利酵母有限公司;(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2:分析純,天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心。

1.2 儀器

PR101數(shù)字折光儀:日本 ATAGO;LRH-250A生化培養(yǎng)箱:廣東省醫(yī)療器械廠;三輥式榨汁機:利寶達廚具機械廠;酒精比重計:河北紅旗儀表有限公司。

1.3 試驗設(shè)計

響應(yīng)面法是通過近似構(gòu)造一個具有明確表達形式的多項式來表達隱式功能函數(shù)。響應(yīng)面法是一套統(tǒng)計方法,用這種方法來尋找考慮了輸入變量值的變異或不確定性之后的最佳響應(yīng)值。在響應(yīng)曲面的最優(yōu)點附近,曲面效應(yīng)是主導(dǎo)項,用二階模型來逼近響應(yīng)曲面。

每個不同變量 X1,X2,X3,…,Xk,表示不同的參數(shù),每個參數(shù)的低、中、高水平分別為 -1,0,+1,見式(1):

式中:Xi和 xi分別代表實際值和編碼值;X0為Xi的中心點,Δx為變化值[18]。

廣義響應(yīng)面模型描述反應(yīng)變量的變化[19]見式(2):

式中:Y為預(yù)測值;β0為回歸系數(shù);βi為 xi的線性效應(yīng);βii為 Xi的二次效應(yīng);βij為 Xi與 Xj間的線性交互效應(yīng)[20]。

選用四種營養(yǎng)鹽,其 Box-Behnken試驗參數(shù)水平見表 1,結(jié)果用統(tǒng)計軟件 Design Expert 7.1.3分析,編碼試驗因素和水平根據(jù)前期單因素試驗進行設(shè)計列于表1。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,采用 Box-Behnken的中心組合設(shè)計對影響發(fā)酵的四種營養(yǎng)鹽 (NH4)2SO4、 MgSO4、KH2PO4、CaCl2進行研究。

因素 符號 編碼水平-1 0 +1 (NH4)2SO4X11 5 9 MgSO4X21 1.5 2 KH2PO4X31.5 3 4.5 CaCl2X40 2.5 5

1.4 液態(tài)發(fā)酵

榨汁:甜高粱秸稈于 2008年 10月收獲后去葉,用三輥式榨汁機壓榨,將甜高粱汁保存于 -18℃的冰柜中,備用。

菌種活化:取定量丹寶利釀酒高活性干酵母溶于 2%蔗糖水中,38℃條件下活化 30 min,然后在34℃活化 1 h,備用。

取 20 Birx的甜高粱汁 200 mL加入到 500 mL的三角瓶中,按 5%接種量接入三角瓶,添加不同的營養(yǎng)鹽,置于(30±2)℃發(fā)酵 3 d后測定酒精度。

1.5 酒精度的測定

取 100 mL發(fā)酵成熟醪液于 500 mL蒸餾瓶中,加 50 mL蒸餾水混合均勻進行蒸餾,用 100 mL容量瓶收集餾出液至 100 mL,酒精含量用酒精比重計法測定,并校正至 20℃時的酒精度[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸模型的確定

Box-Behnken中心組合試驗結(jié)果見表 2?；貧w方程各項回歸系數(shù)顯著性檢驗見表 3。

以 (NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2為自變量,發(fā)酵液酒精度為因變量 Y,建立甜高粱莖稈汁液添加營養(yǎng)鹽發(fā)酵回歸模型。由表 3可知,X1、X2、X3、X4的線性項,X1、X2、X3、X4的平方項,X1與 X2,X1與 X3的交互作用對甜高粱莖稈汁液發(fā)酵的作用是非常顯著的。

利用Design Expert 7.1.3回歸擬合試驗數(shù)據(jù),初步得到回歸方程為:

由表 3可知,X1、X2、X3、X4及其平方項、X1X2、X1X3回歸系數(shù)置信度均在 95%以上,關(guān)系顯著,其他不顯著,所以回歸方程優(yōu)化精簡為:

表 2 Box-Behnken設(shè)計與試驗結(jié)果

表3 回歸方程各項回歸系數(shù)顯著性檢驗

表4 回歸模型方差分析

由表 4可知,回歸方程方差分析顯著性檢驗表明,該模型失擬不顯著,回歸顯著,模型極顯著 (P< 0.000 1)。預(yù)測值與實測值之間具有高度的相關(guān)性系數(shù)R2adj=0.966 2,說明模型能解釋 96.62%的響應(yīng)值變化。調(diào)整相關(guān)系數(shù) R2adj=0.932 5,僅有 6.75%的變異不能由該模型解釋,因此回歸方程的擬合程度很好,預(yù)測值和實測值之間具有高度的相關(guān)性,可以用于甜高粱汁液態(tài)發(fā)酵添加營養(yǎng)鹽生產(chǎn)燃料乙醇的理論預(yù)測。

2.2 發(fā)酵優(yōu)化工藝參數(shù)的驗證

圖形能夠提供一種形象的觀測響應(yīng)值和試驗參數(shù)水平關(guān)系的直觀方法。為了觀察在其他因素條件固定不變的情況下,某兩因素對發(fā)酵的影響,通過上面多元回歸方程做 X1與 X2,X1與 X3的響應(yīng)曲面及其等高線圖,結(jié)果見圖 1～圖 2。

圖 1 響應(yīng)曲面(X1,X2)和等高線圖

圖 2 響應(yīng)曲面(X1,X3)和等高線圖

圖 1表示(NH4)2SO4、MgSO4的交互作用對酒精度的影響。由圖 1可知,二者交互作用顯著。這是因為等高線的形狀可以反映交互效應(yīng)的強弱。圓形表示兩因素交互作用不顯著,而橢圓形表示兩因素交互作用顯著。在 (NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)較低時,隨著MgSO4增大得到的酒精度曲面較陡,這說明較低的(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)對的MgSO4增加較敏感,但是隨著MgSO4的質(zhì)量分數(shù)不斷增加,發(fā)酵液酒精度變化呈先增大后減小的趨勢。

圖 2表示 (NH4)2SO4和 KH2PO4對發(fā)酵產(chǎn)物的影響。在 MgSO4和 CaCl2中心點時,(NH4)2SO4和KH2PO4交互作用顯著。隨著(NH4)2SO4和 KH2PO4添加量的增加,發(fā)酵液酒精度先增加后下降。

為了求得最佳發(fā)酵工藝條件,對所得的回歸擬合方程分別對各自的變量求一階偏導(dǎo)數(shù),并令其為0,得到三元一次方程組,求解此方程組可以得出模型的極值點:X1=-0.098 6,X2=0.279,X3= -0.184,X4=0.127,即 (NH4)2SO4=4.61 g/L, MgSO4=1.64 g/L,KH2PO4=2.72 g/L,CaCl2=2.82 g/L,理論預(yù)測酒精度 Y=9.99%。在此條件下進行驗證試驗,重復(fù) 3次,酒精度為 9.9%。

3 討論

營養(yǎng)鹽可為酵母提供營養(yǎng),促進增殖,改善酵母細胞的生長環(huán)境。張恩銘等[9]以總糖質(zhì)量濃度為178.5 mg/mL的高粱汁液發(fā)酵,經(jīng)正交試驗確定(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2的添加量為為 1、10、5、5 g/L;康利平等[11]采用總糖為 18.03%的甜高粱汁液發(fā)酵,經(jīng)正交實驗的最佳營養(yǎng)鹽添加量為3 g/L尿素,2.5 g/L MgSO4·7H2O,CaCl2·2 H2O 5 g/L,酒精度為 8.35%;王鋒等[22]采用總糖質(zhì)量分數(shù)為 21.7%的甜高粱汁液發(fā)酵,同時在發(fā)酵過程中添加了 (NH4)2SO4,KH2PO4,MgSO4,經(jīng)正交試驗驗證MgSO4對發(fā)酵無益,添加 2 g/L(NH4)2SO4, 5 g/L KH2PO4可得酒精 94.5 g/L。從文獻報道中可知,對于營養(yǎng)鹽的添加種類及數(shù)量不盡相同,除了初始含糖差異,還可能與甜高粱品種及產(chǎn)地造成的莖稈汁液成分差異、以及酵母菌種有關(guān)。

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面分析建立的甜高粱汁發(fā)酵過程中添加(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2與酒精度之間的回歸模型高度顯著,可用于生產(chǎn)預(yù)測?；貧w方程:Y= 9.82-0.12X1+0.32X2-0.23X3+0.18X4-0.20X1X2-0.35X1X3-0.65X12-0.61X22-0.72X32-0.71X42。添加量分別是 (NH4)2SO4為 4.61 g/L、MgSO4為1.64 g/L、KH2PO4為 2.72 g/L、CaCl2為2.82 g/L,于甜高粱汁液態(tài)發(fā)酵,酒精度為 9.9%。由此可知,在甜高粱莖桿汁液液態(tài)發(fā)酵過程中添加營養(yǎng)鹽有利于乙醇的生成。

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Opti mization ofNutrition SaltDoses for Ethanol Fer mentation of Sweet Sorghum Juice with Response SurfaceMethodology

WangMin1,2Wang Jie1Sun Jianfeng1Mou Jianlou1
(College of Food Science and Technology,AgriculturalUniversity of Hebei1,Baoding 071001)
(Department ofLife Science,HengshuiUniversity2,Hengshui 053000)

As one of petroleum substitutes,fuel ethanol will relieve the world energy stress.Using sweet sorghum straw as raw material of ethanol fermentation.the influence of adding nutrition salts on the fermentation was studied. Based on single factor experiments,Box-Behnken central composite design of response surface methodologywas ap2 plied to optimize the addition of nutrition salts including(NH4)2SO4,MgSO4,KH2PO4,and CaCl2for the ethanol fer2 mentation process of sweet sorghum juice.Results:The applicability of the model equation Y=9.92-0.13X1+ 0.32X2-0.23X3+0.18 X4-0.20X1X2-0.35X1X3-0.70X12-0.66X22-0.77X32-0.76X42for predicting the optimum response values is verified effectively by experi mental data.The obtained optimum adding dosesof these salts are(NH4)2SO44.61 g/L,MgSO41.64 g/L,KH2PO42.72 g/L,and CaCl22.82g/L.The validate test shows the prod2 uct alcohol content is 9.9%.

Box-Behnken,response surface methodology,s weet sorghum juice,nutrition salts

TK6 文獻標識碼:A 文章編號:1003-0174(2010)03-0107-06

保定市科技局生物質(zhì)能源加工關(guān)鍵技術(shù)研究(07N12)

2009-04-05

王敏,女,1977年出生,講師,博士,食品加工與安全

王頡,男,1959年出生,教授,博士生導(dǎo)師,食品科學(xué)