卡托普利對博萊霉素致小鼠肺纖維化的防治作用及其機(jī)制探討

彭張哲，朱玉嫻，陶立堅(jiān)，王 菱，寧旺斌

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖南 長沙 410078；2.中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院 腎內(nèi)科，中國 上海 200003）

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（idiopathic pulmonary interstitial fibrosis，IPF）是一種以細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過度合成和沉積為主要特征的、具有嚴(yán)重破壞性的肺部疾病。IPF導(dǎo)致正常肺結(jié)構(gòu)的破壞，包括肺泡間隔增寬，功能性毛細(xì)支氣管腔塌陷，最終出現(xiàn)嚴(yán)重的肺功能不全，目前尚無切實(shí)有效的治療方法[1]。

在肺間質(zhì)纖維化的病理過程中，局部血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）起到了非常重要的作用，該系統(tǒng)中的主要效應(yīng)因子血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）可以通過多種機(jī)制參與肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。如誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡，刺激肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，刺激促纖維化細(xì)胞因子的釋放等[2～4]。因此，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI）或AngⅡ受體拮抗劑可能為肺纖維化的治療提供新的手段。

本研究首先通過尾靜脈分次小劑量注射博萊霉素建立穩(wěn)定的肺間質(zhì)纖維化模型。通過進(jìn)一步觀察卡托普利對小鼠肺纖維化的保護(hù)作用，初步探討其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

博來霉素系日本化藥株式會社產(chǎn)品?？ㄍ衅绽麨橹忻郎虾Ｊ┵F寶制藥有限公司產(chǎn)品。蛋白濃度測定試劑盒購自美國Bio-Rad公司。CTGF抗體購自Abcam公司。β-actin單克隆抗體購自Sigma公司。ECL發(fā)光試劑盒購自Amersham Life Science公司（Little Chalfont，UK）。Trizol購自 Invitrogen公司，熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自日本TaRaKa公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas（MBI）公司。7900熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。圖像分析系統(tǒng)采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院清屏影像公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

1.2.1 造模 45只清潔級ICR小鼠，雄性、7～10周齡、體重約28～39 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供（許可證號：SCXL[滬]2003-0003），小鼠在動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為三組：即正常對照組（15只）、卡托普利組（15只）和模型組（15只）?？ㄍ衅绽M、模型組均給予尾注射10 mg/kg博來霉素持續(xù)14 d[5]。正常對照組按5mL/kg給予生理鹽水尾靜脈注射，持續(xù)14 d。

1.2.2 給藥方案正常對照組小鼠按5mg/（kg·d）給予0.5%CMCNa溶液灌胃；卡托普利組小鼠按12.5mg/（kg·d）給予卡托普利灌胃；模型組小鼠按5 mg/（kg·d）給予0.5%CMCNa溶液灌胃。所有灌胃給藥均從造模前1 d開始給予，持續(xù)28 d。

1.3 標(biāo)本處理、形態(tài)學(xué)觀察及纖維化評分

各組小鼠均于造模開始后第28天處死，采用腹腔內(nèi)注射10%水合氯（3.5～4.0）mL/kg深度麻醉法處死，留取血清及雙側(cè)肺臟。左側(cè)肺臟用4%甲醛固定、石蠟包埋、制成4μm厚切片，做HE染色及Masson染色。參照SZAPIEL[6]觀察肺泡炎（0～3分）和肺纖維化（0～3分）。

1.4 Western blot測定CTGF蛋白表達(dá)

取肺組織勻漿，蛋白定量后行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉后加入CTGF一抗（1︰1 000），4℃過夜后加入1︰10 000稀釋的二抗，室溫孵育60min，加入ECL液后于暗室中膠片顯影曝光。內(nèi)參照為β-actin。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行掃描之后，采用Bio-Rad公司的圖形分析軟件Quantity One對特異性條帶進(jìn)行灰度分析。以CTGF/β-actin的光密度值表示CTGF的相對表達(dá)量。

1.5 RNA抽提、cDNA合成與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

應(yīng)用Trizol抽提小鼠肺臟中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后再進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。引物序列設(shè)計(jì)通過Primer3軟件完成，各目的基因引物如下：CollagenⅠ上游引物序列5'-CCCAGAGTGGAACAGC GATTAC-3'；下游引物序列5'-TGTCTTGCCCCATTC ATTTGTC-3'。CollagenⅢ上游引物序列：5'-CCTCAG GGTATCAAGGGTG-3'；下游引物序列5'-GATCCAG GGTTTCCATCC-3'。TGF-β1上游引物序列：5'-AG GCGGTGCTCGCTTTGT-3'；下游引物序列5'-TGTTG CGGTCCACCATTAGC-3'。CTGF上游引物序列5'-GTGTGTGACGAGCCCAAGGA-3'；下游引物序列5'-AGTTGGGTCTGGGCCAAATGT-3'。GAPDH 上游引物序列5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3'；下游引物序列5'-TGTTGCGGTCCACCATTAGC-3'。反應(yīng)條件為：①變性95℃ 10 s；②PCR反應(yīng)95℃5s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；③溶解曲線95℃ 15 s，60℃15 s，95℃ 15 s。最后根據(jù)ΔΔCt方法對樣品的mRNA含量進(jìn)行定量分析[7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大體形態(tài)觀察

正常對照組：雙肺呈粉紅色，表面光滑，彈性良好。模型組：雙肺呈灰白色，或蒼白色，表面有出血點(diǎn)和壞死灶，質(zhì)地較硬，體積縮小?？ㄍ衅绽M：部分肺葉暗紅色或灰白色，表面有出血點(diǎn)和壞死灶，部分肺葉表面光滑。

2.2 光鏡觀察

正常對照組未出現(xiàn)明顯病變，模型組大量炎性細(xì)胞浸潤，同時(shí)出現(xiàn)肺纖維化病變，部分肺泡腔消失，為大量膠原纖維、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞所占據(jù)?？ㄍ衅绽委熃M可見肺泡間隔增厚程度稍減輕，炎性細(xì)胞較少，可見中量膠原纖維?？ㄍ衅绽委熃M的肺泡炎及肺纖維化程度較模型組有減輕的趨勢，但半定量評分結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，圖2，表1）。

圖1 三組小鼠肺組織病理改變（HE×100）

圖2 三組小鼠肺組織病理改變（Masson×100）

表1 三組小鼠肺組織肺泡炎、肺纖維化半定量評分結(jié)果（±s）

表1 三組小鼠肺組織肺泡炎、肺纖維化半定量評分結(jié)果（±s）

注：?與對照組比較，P＜0.01

組別 鼠數(shù)（只） 肺泡炎評分 肺纖維化評分對照組 15 1.22±0.44 0.33±0.52模型組 15 3.00±0.00? 3.00±0.00?卡托普利組 15 2.71±0.48? 2.33±0.82?

2.3 Real-time PCR檢測各組小鼠肺組織中CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA水平

Ⅰ型膠原：與正常組比較，造模后兩組的Ⅰ型膠原mRNA水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，卡托普利組能下降Ⅰ型膠原mRNA水平（P＜0.01）。Ⅲ型膠原：與正常組比較，造模后兩組的Ⅲ型膠原均顯著升高（P＜0.01）；卡托普利組的Ⅲ型膠原mRNA水平與模型組相比并無明顯差別（表2）。

表2 肺組織I、III型膠原m RNA水平比較（±s）

表2 肺組織I、III型膠原m RNA水平比較（±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.01；2）與模型組比較，P＜0.01

組別 鼠數(shù)（只） I型膠原mRNA III型膠原mRNA對照組51.08±0.08 1.23±0.37模型組53.51±0.161） 4.41±0.301）卡托普利組52.79±0.221）2） 4.30±0.201）

2.4 Real-time PCR檢測各組小鼠肺組織中TGFβ1、CTGF mRNA 的表達(dá)

相對于正常對照組，博萊霉素尾靜脈注射14 d后小鼠肺組織中TGF-β1表達(dá)增高4.86倍，CTGF的mRNA表達(dá)量在模型組小鼠肺組織中也增高了3.62倍。經(jīng)過卡托普利治療28d之后，TGF-β1mRNA與CTGF mRNA表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）（表3）。

2.5 Western-blot檢測CTGF蛋白表達(dá)

Western-blot檢測結(jié)果顯示：相對于正常對照組，模型組小鼠肺組織中CTGF蛋白表達(dá)顯著增高（P＜0.01），經(jīng)過卡托普利治療28 d之后，小鼠肺組織 CTGF的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01）（圖 3）。

圖3 各組小鼠CTGF蛋白表達(dá)

表3 肺組織TGFβ1、CTGF m RNA表達(dá)水平比較（±s）

表3 肺組織TGFβ1、CTGF m RNA表達(dá)水平比較（±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.01；2）與模型組比較，P＜0.01

組別 鼠數(shù)（只） TGFβ1 mRNA CTGF mRNA對照組51.21±0.26 1.31±0.37模型組54.86±0.341） 3.62±0.421）卡托普利組52.95±0.621）2） 2.88±0.411）2）

3 討論

博萊霉素是一種細(xì)胞毒性藥物，具有致肺纖維化的作用，是目前應(yīng)用最為廣泛的建立肺纖維化動物模型的方法。目前，在國內(nèi)用博萊霉素復(fù)制肺纖維化動物模型，多應(yīng)用氣管內(nèi)滴入法。該造模方法需要進(jìn)行暴露氣管的手術(shù)，方法比較繁瑣，且有一定感染的危險(xiǎn)性。該方法形成的組織病理改變主要集中在細(xì)支氣管的周圍，不符合IPF的病理變化[8]，不利于觀察藥物療效。本文參考國外文獻(xiàn)[5]，通過尾靜脈多次注射小劑量博萊霉素的方法形成了廣泛而穩(wěn)定的肺間質(zhì)纖維化改變，這些病理改變主要分布于胸膜下及血管周圍，這與IPF的病理變化相似，并且該方法操作簡單，減少了感染及氣管切開帶來的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。本文的研究顯示，通過尾靜脈注射博萊霉素的造模方法在一定程度上優(yōu)于氣管內(nèi)給藥的方法。

Ⅰ型和Ⅲ型膠原構(gòu)成肺組織基質(zhì)的主要成分，其中Ⅰ型膠原的含量最為豐富，主要見于支氣管樹和血管樹的周圍即肺泡周間質(zhì)，僅有少量的散布于肺泡間質(zhì)內(nèi)。Ⅲ型膠原則主要見于肺泡間質(zhì)內(nèi)，包括肺泡壁、小葉間隔，構(gòu)成了肺間質(zhì)的主要膠原成分。在肺間質(zhì)纖維化的早期，主要以Ⅲ型膠原的增多為主，慢性及終末期則以Ⅰ型膠原增長為主[9，10]。本文的試驗(yàn)結(jié)果顯示：14 d博萊霉素所致小鼠肺纖維化模型Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA水平都顯著增高，但Ⅲ型膠原mRNA水平較一型膠原mRNA增高更為明顯。結(jié)合對肺組織病理切片的觀察我們認(rèn)為：14 d博萊霉素尾靜脈注射小鼠肺纖維化模型的肺部病變?nèi)詫俜伍g質(zhì)纖維化的早中期，以Ⅲ型膠原的增多為主。本文進(jìn)一步證實(shí)卡托普利能夠顯著降低肺纖維化組織中升高的Ⅰ型膠原mRNA水平，而對Ⅲ型膠原mRNA水平無明顯影響。本文同時(shí)發(fā)現(xiàn)，卡托普利治療組對于模型組有減輕肺間質(zhì)纖維化的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與卡托普利只降低了Ⅰ型膠原的mRNA水平而對Ⅲ型膠原mRNA水平無明顯影響相關(guān)。這可能提示卡托普利對早中期的肺間質(zhì)纖維化程度影響不大，而當(dāng)纖維化進(jìn)入晚期以Ⅰ型膠原沉積為主時(shí)，才能夠通過干擾膠原合成起到抗肺間質(zhì)纖維化的作用。

有國外文獻(xiàn)報(bào)道，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利能通過抑制肺泡上皮細(xì)胞凋亡抗肺間質(zhì)纖維化[11，12]。另有學(xué)者也證明，卡托普利抗放射性肺纖維化的機(jī)制與下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子 1（TGF-β1）、α-SMA水平有關(guān)[13]。TGFβ1是組織生長、修復(fù)炎癥的重要細(xì)胞因子，TGFβ1的激活和異常表達(dá)總是伴隨著肺實(shí)質(zhì)的病變，包括肺間質(zhì)纖維化以及其它的氣道疾病。在博萊霉素導(dǎo)致肺纖維化的模型中，總是能觀察到TGFβ1的過度表達(dá)、活化以及其下游的信號傳導(dǎo)途徑激活[14～17]。用各種方式阻斷或下調(diào)TGFβ1的過度表達(dá)，能夠明顯緩解肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展[18，19]。結(jié)締組織生長因子（CTGF）是目前得到公認(rèn)TGF-β1的下游效應(yīng)介質(zhì)，與TGF-β1一起參與了眾多組織的細(xì)胞增殖及ECM的合成。CTGF主要介導(dǎo) TGF-β1的促纖維化效應(yīng)，而TGF-β1的其它效應(yīng)卻不由CTGF介導(dǎo)，所以CTGF的生物學(xué)行為更為專一，具有更強(qiáng)的靶向性[20～23]。本文的研究顯示，卡托普利不但能夠降低肺纖維化組織中TGFβ1的mRNA水平，還能同時(shí)降低其下游的CTGF的mRNA和蛋白表達(dá)。這說明抑制激活的TGFβ1/CTGF通路是卡托普利抑制Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗肺間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制之一。

4 致謝

（本實(shí)驗(yàn)均在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，真摯感謝醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的技術(shù)支持以及儀器設(shè)備等硬件支持）。

[1]CRYSTAL RG,BITTERMAN PB,MOSSMAN B,et al.Future research directions in idiopathic pulmonary fibrosis:summary of a national heart,lung,and blood institute working group[J]. Am J Respir Crit Care Med,2002,166:236-246.

[2]WANG R,ZAGARIYA A.AngiotensinⅡinduces apoptosis in human and rat alveolar epithelial cells[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,1999,276:L885-L889.

[3]MARSHALL RP,GOHLKE P,CHAMBERS RC,et al.AngiotensinⅡand the fibroproliferative response to acute lung injury[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2004,286(1):L156-164.

[4]WANG R,ZAGARIYA A,ANG E,et al.Fas-induced apoptosis of alveolar epithelial cells requires ANGⅡgeneration and receptor interaction[J].Am J Physiol,1999,277 (6 Pt 1):L1245-1250.

[5]T.KAKUGAWA,H.MUKAE,T.HAYASHI,et al.Pirfenidone attenuates expression of HSP47 in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Eur Respir J,2004,24:57-65.

[6]SZAPIEL SV,ELSON NA,FULMER TD,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the Nude,Athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis,1979,120:893-899.

[7]WINER J,JUNG CK,SHACKEL I,et al.Development and validation of real-time quantitative reverse transcriptase?polymerase chain reaction for monitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro[J].Anal Biochem,1999,270:41-49.

[8]CHUA F,GAULDIE J,LAURENT GJ,et al.Pulmonary fibrosis:searching for model answers[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2005,33(1):9-13.

[9]GERRIETS JE,REISER KM,LAST JA.Lung collagen cross-links in rats with experimentally induced pulmonary fibrosis[J].Biochim Biophys Acta,1996,1316(2):121-131.

[10]ZHANG K,REKHTER MD,GORDON D,et al.Myofibroblast and their role in lung collangen gene expression during pulmonary fibrosis;a combined immunohistochemical and insituhybridization study[J].Am J Pathol,1994,145(2):114-125.

[11]WANG R,IBARRA-SUNGA O,VERLINSKI L,et al.Abrogation of bleomycin-induced epithelial apoptosis and lung fibrosis by captopril or by a caspase inhibitor[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2000,279(1):L143-151.

[12]CANDAN F,ALAGOZLU H.Captopril inhibits the pulmonary toxicity of paraquat in rats[J].Hum Exp Toxicol,2001,20(12):637-641.

[13]MOLTENI A,WOLFE LF,WARD WF,et al.Effect of an angiotensinⅡreceptor blocker and two angiotensin converting enzyme inhibitors on transforming growth factor-beta(TGF-beta)and alpha-actomyosin(alpha SMA),important mediators of radiation-induced pneumopathy and lung fibrosis[J].Curr Pharm Des,2007,13(13):1307-1316.

[14]KHALIL N,PAREKH TV O'CONNOR RN,GOLD L et al.Differential expression of tansforming growth factor-β type ⅠandⅡreceptors by pulmonary cells in bleomycin-induced lung injury:correlation with repair and fibrosis[J].Exp Lung Res,2002,28:233-250.

[15]ZHAO J,SHIW,WANG YL,et al.Smad3 deficiency attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2002,282:L585-L593.

[16]GAULDIE J.Pro-inflammatory mechanisms are a minor component of the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am J Respir Crit Care Med,2002,165:1205-1206.

[17]KEANE MP,STRIETER RM.The importance of balanced pro-inflammatory and anti-inflammatory mechanisms in diffuse lung disease[J].Respir Res,2002,3:5.

[18]GAULDIE.TGFβand Smad3 link inflammation to regressive fibrosis[J].International Congress Series,2007,1302:103-113.

[19]BONNIAUD P,MARTIN G,MARGETTS PJ,et al.CTGF is crucial to induce a profibrotic environment in‘fibrosis resistant alb/c mouse lungs’[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2004,31(5):510-516.

[20]XU YD,HUA J.Release of biologically active TGF-β1 by alveolar epithelial cells results in pulmonary fibrosis[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2003,285:L527-539.

[21]DUNCAN MR,FRAZIER KS,ABRAMSON S,et al.Connective tissue growth factor mediates transforming growth factor beta-induced collagen synthesis:down-regulation by cAMP[J].FASEB J,1999,13:1774-1786.

[22]HISIKAWA K,NAKAKI T,FUJII T,et al.Transforming growth factor-beta1 induces apoptosis via connective tissue growth factor in human aortic smooth muscle cells[J].Eur J Pharmacol,1999,385:287-290.

[23]M.M.CHEN,A.LAM,J.A.ABRAHAM,et al.CTGF Expression is induced by TGF-βin cardiac fibroblasts and cardiac myocytes:a potential role in heart fibrosis[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology,2000,32:1805-1819.