玻璃體腔聯(lián)合用藥治療實驗性外傷性玻璃體出血*

招志毅，彭燕一

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院 眼科，廣西 桂林 541001）

眼外傷常常引起玻璃體腔內(nèi)出血，導致增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopathy，PVR）。伴玻璃體出血的眼球穿通傷PVR發(fā)生率遠遠高于視網(wǎng)膜脫離手術后PVR發(fā)生率[1]。目前，治療玻璃體出血的藥物并不理想。蛇毒降纖酶是從尖吻蝮蛇毒液中分離、純化的凝血酶樣酶制劑。藥理上它能降低血漿中纖維蛋白原含量，以及激發(fā)血管內(nèi)皮細胞釋放組織型溶纖酶原激活物，激活纖溶酶原，水解纖維蛋白，促進出血的吸收[2]。曲安奈德是一種長效糖皮質(zhì)激素，能夠減輕炎癥反應，抑制細胞的增生，有減輕PVR形成的作用[3，4]。本實驗觀察了蛇毒降纖酶聯(lián)合曲安奈德在外傷性玻璃體出血的治療效果，并對其玻璃體腔細胞因子的變化進行了檢測。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康新西蘭大白兔40只，體重2.25～2.5 kg，雌雄各半，右眼為實驗眼，左眼為空白對照眼。右眼隨機分為生理鹽水組（10眼）、蛇毒降纖酶組（10眼）、曲安奈德組（10眼）、聯(lián)合用藥組（10眼）。

1.1.2 主要試劑和儀器 蛇毒降纖酶5u/瓶（廣西醫(yī)科大學蛇毒研究所提供），曲安奈德40mg/（mL·瓶）（昆明積大制藥有限公司），MMP-9、TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒由美國Bionewtrans Pharmaciutical公司提供。Clinibio128酶標檢測儀，電子顯微鏡（日本HITACHI H-600型）。

1.2 動物模型制作

術前3 d點用洛美沙星眼液，復方托品酰胺散瞳，肌肉內(nèi)注射氯胺酮35mg/kg+氯丙嗪5mg/kg，分離上方9～3點的球結膜，在角膜緣后2mm處用鞏膜穿刺刀刺向玻璃體中心部，勿傷及晶狀體及周邊視網(wǎng)膜，用剪刀向兩側擴大切口，切口與角膜緣平行，達8mm，輕壓眼球，將脫出的玻璃體剪除，用8-0尼龍線間斷縫合切口。以2mL注射器抽取兔耳動脈血1mL，玻璃體腔注入0.3mL全血。用1mL注射器按實驗各組要求把藥物注入玻璃體：生理鹽水組注射生理鹽水0.1mL；蛇毒降纖酶組注射蛇毒降纖酶0.1 u/0.1mL；曲安奈德組注射曲安奈德1.0mg/0.1mL；聯(lián)合用藥組分別注射曲安奈德1.0mg/0.1mL及蛇毒降纖酶0.1 u/0.1mL。

1.3 實驗方法

1.3.1 玻璃體出血指數(shù)觀察 采用文獻報道[5]分級方法。根據(jù)眼底4個象限可見程度分0～3級，各象限級別相加，總和即為指數(shù)。0級：積血完全吸收，眼底清晰。1級：玻璃體輕度積血，眼底輕度模糊，但尚能看清。2級：玻璃體中度積血，眼底很難看清，僅可見模糊結構。3級：玻璃體重度積血，眼底窺不進。手術后每2天使用直接眼底鏡檢查眼底情況，記錄玻璃體出血指數(shù)。

1.3.2 PVR分級觀察 采用Fastenberg分級方法[6]。手術后每2天使用直接眼底鏡檢查眼底情況，記錄PVR程度。

1.3.3 玻璃體液MMP-9、TGF-β1濃度檢測 手術后7、14 d實驗眼抽取0.1mL玻璃體液，ELISA檢測MMP-9、TGF-β1光密度值。具體操作見試劑盒說明書。計算MMP-9、TGF-β1濃度。

1.4 視網(wǎng)膜毒性評價

手術后28 d取離視盤下方2mm處視網(wǎng)膜行常規(guī)HE染色、醋酸雙氧鈾與枸櫞酸鉛雙重染色后行光學和電子顯微鏡檢查。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差（±s）表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)分析采用t-test、ANOVA及非參數(shù)檢驗Mann-Whitney Test法。

2 結果

2.1 玻璃體出血指數(shù)觀察

手術后3 d聯(lián)合用藥組、蛇毒降纖酶組的眼底逐漸清晰，玻璃體塵狀混濁，基本能看到視網(wǎng)膜情況；生理鹽水組、曲安奈德組仍見玻璃體棕色混濁，眼底窺不清。見表1。

表1 手術后3 d玻璃體出血指數(shù)（±s）

表1 手術后3 d玻璃體出血指數(shù)（±s）

注：?表示與生理鹽水組比較

組別 眼數(shù) 指數(shù) P（Mann-Whitney Test）生理鹽水組 10 9.5±0.6 -蛇毒降纖酶組 10 6.5±0.7 P＜0.01?曲安奈德組 10 9.0±0.8P＞0.05?聯(lián)合用藥組 10 6.8±0.4P＜0.01?

2.2 PVR分級觀察

手術后28d聯(lián)合用藥組PVR程度低于生理鹽水組，兩組 PVR 程度比較：P=0.0013＜0.01（Mann-Whitney test）。聯(lián)合用藥組PVR程度與蛇毒降纖酶組、曲安奈德組未見統(tǒng)計學意義，分別為P=0.4359＞0.05；P=0.3742＞0.05；（Mann-Whitney test）。見表2。

表2 手術后28 d PVR分級（例數(shù)）

術后28 d聯(lián)合用藥組4眼（40%）發(fā)生視網(wǎng)膜脫離，比生理鹽水組（100%）、蛇毒降纖酶組（50%）及曲安奈德組（60%）低。

2.3 玻璃體腔中MMP-9檢測

手術后7d、14d聯(lián)合用藥組玻璃體液MMP-9濃度比生理鹽水組低（分別為t值：3.512、P值=0.0025＜0.01；t值：6.7545、P值=0.0005＜0.01；t-test）；與曲安奈德組、蛇毒降纖酶組相比未見統(tǒng)計學意義（分別為7d t值：2.0068、P值=0.06＞0.05；t值：0.1574、P值=0.8767＞0.05；14 d t值：1.4024、P ＞0.05；t值：1.299、P值=0.2351＞0.05；t-test）。見表3。

表3 玻璃體液MMP-9濃度的比較（pg/mL，±s）

表3 玻璃體液MMP-9濃度的比較（pg/mL，±s）

注：1）各組間玻璃體液 MMP-9 含量比較，P=0.024＜0.05；2）P=0.017＜0.05；（Kruskal-wallis ANOVA）

組別生理鹽水組蛇毒降纖酶組曲安奈德組聯(lián)合用藥組7d1） 14d2）343.75±57.19 384.64±33.22 231.56±39.48 283.39±44.44 321.52±109.71 313.57±85.56 235.93±78.45 251.79±21.07

2.4 玻璃體腔中TGF-β1檢測

手術后7 d、14 d聯(lián)合用藥組玻璃體液TGF-β1濃度比生理鹽水組低（分別為t值：2.8445、P值=0.0108＜0.05；t值：3.2426、P值=0.0176＜0.05；t-test；）。與蛇毒降纖酶組、曲安奈德組相比未見統(tǒng)計學意義（分別為7d t值：0.3315、P值=0.7441＞0.05；t值：0.4282、P值=0.6736＞0.05；14 d t值：1.3245、P值=0.2269＞0.05；t值：1.052、P值=0.087＞0.05；t-test）。見表4。

表4 玻璃體液TGF-β1濃度的比較（pg/mL，±s）

表4 玻璃體液TGF-β1濃度的比較（pg/mL，±s）

注：1）各組間玻璃體液 TGF-β1 含量比較，P=0.036＜0.05；2）P=0.025＜0.05；（Kruskal-wallis ANOVA）

組別生理鹽水組蛇毒降纖酶組曲安奈德組聯(lián)合用藥組7d1） 14d2）102±35.47 123.18±34.34 65.58±25.52 80.65±21.04 56.67±24.47 51.41±13.13 61.65±27.46 65.53±9.23

2.5 視網(wǎng)膜毒性評價

視網(wǎng)膜光鏡檢查見聯(lián)合用藥組視網(wǎng)膜各層結構整齊；電鏡檢查視網(wǎng)膜內(nèi)外節(jié)排列整齊。

3 討論

本實驗嘗試玻璃體腔聯(lián)合應用促進出血吸收的藥物蛇毒降纖酶和抗炎藥物曲安奈德治療實驗性外傷性玻璃體出血，觀察其對治療玻璃體出血及防治PVR的效果。蛇毒降纖酶是從蛇毒提取經(jīng)生物技術純化精制的一種強效凝血酶樣酶，可直接作用于血漿纖維蛋白原的肽鏈A，形成脫肽鏈A纖維蛋白可溶性單體而被溶纖酶迅速消溶；另外，蛇毒降纖酶還能激發(fā)血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生組織溶纖酶原激活物促進出血的吸收[2]。曲安奈德是一種長效糖皮質(zhì)激素，具有很強的抗炎作用，可降低炎癥血管的滲透性、減少血-視網(wǎng)膜屏障的破壞。有學者報道，玻璃體腔應用曲安奈德可以減輕PVR形成的程度[3，4]。在本實驗中，聯(lián)合用藥組玻璃體出血指數(shù)、PVR程度明顯比生理鹽水組低，說明蛇毒降纖酶和曲安奈德能明顯促進玻璃體腔出血的吸收，以及降低PVR的發(fā)展程度。通過實驗各組視網(wǎng)膜脫離率的比較，我們發(fā)現(xiàn)玻璃體腔聯(lián)合用藥組較單一用藥更能降低視網(wǎng)膜脫離率的發(fā)生。

在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組玻璃體液MMP-9、TGF-β1濃度比生理鹽水組低。目前認為，細胞因子對增殖細胞遷移、增生的調(diào)控起著重要的作用。MMP-9是一種含有鋅指結構的中性蛋白酶，可由視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞及巨噬細胞分泌，具有降解變性膠原分子及天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型天然膠原的活性，并參與了炎癥反應和傷口愈合過程[7，8]。有學者認為，其與纖維增生性PVR形成有關[9～11]。TGF-β1是一種多功能、高度雙向的細胞調(diào)節(jié)因子，能促進單核細胞、成纖維細胞遷移和增殖卻抑制上皮細胞、內(nèi)皮細胞的分裂和增殖，血小板是其最主要的來源，但玻璃體腔中RPE細胞及巨噬細胞也能分泌并釋放TGF-β1。有文獻報道，TGF-β1始終參與 PVR 的發(fā)生及發(fā)展[12，13]。聯(lián)合用藥組通過曲安奈德抗炎作用，使向玻璃體腔遷移的RPE細胞、巨噬細胞及血小板較生理鹽水組減少；通過蛇毒降纖酶促進出血吸收的作用，減輕了玻璃體出血引起的、以巨噬細胞為主的慢性玻璃體炎癥。因此，我們推測這可能是聯(lián)合用藥組玻璃體腔的MMP-9、TGF-β1濃度較生理鹽水低的原因。相反，玻璃體腔MMP-9、TGF-β1濃度的降低反過來又抑制增殖細胞遷移、增生以及細胞外基質(zhì)的形成。我們推想，這可能是聯(lián)合用藥組PVR程度低于生理鹽水組、視網(wǎng)膜脫離率低于各組的原因。

在本實驗中，聯(lián)合用藥組玻璃體液MMP-9、TGF-β1濃度與蛇毒降纖酶組、曲安奈德組相比未見統(tǒng)計學意義，這是否是聯(lián)合用藥組PVR程度與曲安奈德組、蛇毒降纖酶組相比下降不明顯的原因之一，還待進一步研究。最后，通過視網(wǎng)膜光鏡、電鏡檢查，未見聯(lián)合用藥對視網(wǎng)膜有毒性作用。

綜上所述，玻璃體腔曲安奈德和蛇毒降纖酶聯(lián)合應用可以促進玻璃體腔出血的吸收、降低外傷性PVR程度；同時，下調(diào)玻璃體腔MMP-9、TGF-β1濃度。與單獨應用曲安奈德、蛇毒降纖酶相比，玻璃體腔聯(lián)合用藥更能降低視網(wǎng)膜脫離率的發(fā)生，但PVR下降程度與單一藥物組相比未見統(tǒng)計學意義。

[1]CARDILLO JA,STOUT T,LABREE L,et al.Post-traumatic proliferative vitreoretinopathy.The epidemiologic profile,onset,risk factors,and visual outcome[J].Ophthalmology 1997,104:1166-1173.

[2]FU MG,GUAN JX.Progress in the research of the fihrino(ceno)lytic enzymes from snake venoms[J].Journal of Snake,1996,8(6):33-36.Chinese

[3]TANO Y,CHANDLERD,MACHEMER R,et al.Treatment of intraocular proliferation with intravitreal injection of triamcinolone acetonide[J].Am J Ophthalmol,1980,90(6):810-816.

[4]ENAIDA H,HATA Y.Possible benefits of triamcinolone-assisted pars plana vitretomy for retinal diseases[J].Retina,2003,23:764-770.

[5]ARCHJOHNSON RN,OLSEN KR,HERNANDEZ E.Intravitreal tissue plasminogen activator treatment of experimental vitreous hemorrhage[J].Arch Ophthalmol,1989,107(7):891-894.

[6]FASTERNBERG DM,DIDDIE KR,SORGENTE N,et al.A comparison of different cellular inocula in an experimental modelof massive periretinal proliferation[J].Am J Ophthalmol,1982,93:559-572.

[7]SHERIDAN CM,OCCLESTONNL,HISCOTT P,et al.Matrixmetalloproteinases:a role in the contraction of vitreo-retinal scar tissue[J].Am J Pathol,2001,159(4):1555-1561.

[8]ABU EL-ASRAR AM,DRALANDS L,VECKENEER M,et al.Gelatinase B in proliferative vitreoretinal disorders[J].Am J Ophthalmol,1998,125:844.

[9]ABU EL-ASRAR AM,VAN DEN STEEN PE,AL-AMRO SA et al.Expression of angiogenic and fibrogenic factors in proliferative vitreoretinal disorders[J].Int Ophthalmol,2007,27(1):11-22.

[10]SYMEONIDIS C,DIZA E,PAPAKONSTANTINOU E,et al.Expression of matrix metalloproteinases in the subretinal fluid correlates with the extent of rhegmatogenous retinal detachment[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2007,245(4):560-568.[11]KON CH,OCCLESTON NL,CHARTERIS DG,et al.A prospective study of matrix metalloproteinases in proliferative vitreoretinopathy[J].Invest Ophthalm ol Vis Sci,1998,39:1524-1529.

[12]WANG F,XU X,ZHANG X,et al.Electron-immunostaining characteristics of platelet-derived growth factor,transforming growth factor-β1 and their receptors in epiretinal membranes[J].Chin J Ophthalmol,2000,36(5):369-371.Chinese

[13]XU X,HU HH,WANG F.The detection of transforming growth factor-β1 and its receptors cells in subretinal fluid[J].Chin Ophthal Res,2001,19(3):235.Chinese