芡實(shí)多糖的粗提取及其對(duì)羥自由基的清除效果

趙翾，李紅良，葉倩雯

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，輕工食品學(xué)院，廣東廣州，510225) 2(東莞市廣益食品添加劑有限責(zé)任公司，廣東東莞，523220)

芡實(shí)多糖的粗提取及其對(duì)羥自由基的清除效果

趙翾1，李紅良2，葉倩雯1

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，輕工食品學(xué)院，廣東廣州，510225) 2(東莞市廣益食品添加劑有限責(zé)任公司，廣東東莞，523220)

對(duì)芡實(shí)多糖的提取工藝進(jìn)行了研究，并探討了其對(duì)羥自由基的清除效果。通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察了浸提溫度、浸提時(shí)間、乙醇濃度、水料比對(duì)芡實(shí)多糖提取量的影響，并確定了各因素的適用范圍。利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，并通過(guò)響應(yīng)面分析法確定了芡實(shí)多糖的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明:芡實(shí)多糖的最佳提取工藝條件為浸提溫度92℃，浸提時(shí)間6 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，水料比26∶1(mL∶g)，提取的芡實(shí)多糖提取量為0.62 mg/g，其對(duì)羥自由基的清除率為46.42%。

芡實(shí)，多糖，羥自由基，提取，清除，響應(yīng)面法

芡實(shí)(Semen euryales)是睡蓮科1年生水生草本植物芡(Euryale ferox Salisb)的種子成熟種仁［1］，是我國(guó)傳統(tǒng)著名滋補(bǔ)防病保健中藥材之一，具有養(yǎng)血安神、益腎固精、去濕健脾、止瀉止滯等保健功效，對(duì)腎虧脾虛，小便失禁、白帶崩下、慢性腹瀉、輕度浮腫、腰腿關(guān)節(jié)痛等癥均有顯著的治療作用。芡實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量較豐富，氨基酸總量豐富且種類齊全，維生素含量也較為豐富;碳水化合物含量高達(dá)77%～78%，除6%左右為不溶性纖維素外，多數(shù)可被人體消化吸收，是比較理想的膳食纖維源［2～4］。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件并能研究各因素間交互作用的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，該方法試驗(yàn)次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精度高，已經(jīng)被廣泛用于食品工業(yè)［5］。本試驗(yàn)利用中心組合設(shè)計(jì)(central composite design)優(yōu)化芡實(shí)多糖的提取工藝，為進(jìn)一步研究芡實(shí)多糖的組成、結(jié)構(gòu)和其與生物學(xué)活性提供必要的科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

芡實(shí)(市售);濃硫酸、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、苯酚、水楊酸、無(wú)水乙醇等，均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

6202高速粉碎機(jī)(北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司)，HWS12型電子恒溫水浴鍋(上海恒科科學(xué)儀器有限公司)，BS110S型分析天平(常熟雙杰測(cè)試儀器廠)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，LXJ-ⅡB型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，SpectrumLab54紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)。

1.3 芡實(shí)多糖提取方法

芡實(shí)多糖的提取采用水溶醇析法，其原理是根據(jù)多糖較易溶于水、堿、酸當(dāng)中，而難溶于乙醇、石油醚、氯仿等溶劑的性質(zhì)，用水先將粗多糖從芡實(shí)中提取出來(lái)，然后加入乙醇將其沉淀，同時(shí)除去單糖、低聚糖、甙類及生物堿等雜質(zhì)［8］。具體操作流程如下:

芡實(shí)→粉碎過(guò)篩→芡實(shí)粉→熱水浸提→浸提液→離心→上清液→真空濃縮→乙醇沉淀→粗多糖→測(cè)定多糖含量

1.4 多糖測(cè)定方法

本研究采用苯酚-硫酸法［9］測(cè)定多糖提取量。

1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取0.040 2 g葡萄糖，用蒸餾水溶解后定容到500mL，搖勻配制成80.4μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確吸取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，分別置于試管中，加蒸餾水補(bǔ)至2mL。加5%苯酚試液1mL，搖勻。迅速滴加濃硫酸5mL，快速搖勻，放置5 min。置沸水浴中加熱15 min，取出，用冷水迅速冷卻至室溫。同時(shí)用蒸餾水作空白，于490 nm處測(cè)定吸光度。

1.4.2 換算因子的計(jì)算

精密稱取干燥至恒重的芡實(shí)多糖20 mg，用蒸餾水溶解后定容至100mL。吸取多糖溶液0.5mL，按照1.4.1測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算出溶液中葡萄糖的含量，按下式計(jì)算換算因子。

式中:m為稱取多糖的質(zhì)量(μg)，c為多糖液中葡萄糖的含量(μg/mL)，D為多糖的稀釋倍數(shù)。測(cè)定濃度為0.20μg/mL的芡實(shí)多糖吸光度為0.35，計(jì)算得換算因子為1.60。

1.4.3 芡實(shí)多糖提取量的計(jì)算

稱量芡實(shí)粉末(過(guò)40目篩)，按料液比1∶30(g∶mL)加入蒸餾水，水浴浸提2 h，浸提液3 000 r/min離心15 min后取上清液，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到10mL，然后加入乙醇溶液沉淀，棄去上清液，沉淀加水溶解并定容至250mL。吸取0.5mL測(cè)定多糖的含量。

其中:m'，試液中葡萄糖的質(zhì)量(μg);f，換算因子;V，測(cè)定時(shí)吸取的樣品液體積(mL);250，稀釋樣液總體積;m，稱取試樣質(zhì)量(g)。

1.4.4 羥自由基清除率的測(cè)定

本試驗(yàn)采用水楊酸作為羥自由基捕捉劑，在Smironff等報(bào)道的方法上進(jìn)行改進(jìn)。具體測(cè)定方法如下:在試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2mL、不同濃度粗多糖溶液2mL、6 mmol/L H2O2溶液2mL，搖勻，靜置10 min。再加入6 mmol/L水楊酸溶液2mL，搖勻，靜置30 min后于510 nm處測(cè)得不同粗多糖濃度下的吸光度Ai，用水代替水楊酸時(shí)測(cè)得某濃度粗多糖的吸光度為本底吸光度Aj，用水代替抗氧化劑時(shí)測(cè)得的吸光度為對(duì)照吸光度A0。按下式計(jì)算得到羥自由基的清除率［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提溫度對(duì)多糖提取量及芡實(shí)多糖清除羥自由基效果的影響

稱取2 g粉碎度為40目的芡實(shí)粉，加入60mL的蒸餾水，分別置于 50、60、70、80、90、100 ℃下浸提2 h，浸提離心后取上清液濃縮，加入3倍體積的70%乙醇沉淀12 h，加水溶解并測(cè)定多糖提取量及其對(duì)羥自由基的清除率。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 浸提溫度對(duì)多糖提取量及芡實(shí)多糖清除羥自由基效果的影響

由圖1可知，隨著浸提溫度的升高，芡實(shí)多糖的含量增加較明顯，溫度上升到90℃時(shí)，浸出的多糖提取量達(dá)到最大值;當(dāng)溫度超過(guò)90℃以后，多糖的含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。芡實(shí)多糖清除羥自由基的能力隨浸提溫度變化的趨勢(shì)相同。故浸提溫度選擇在90℃左右比較適宜。

2.2 浸提時(shí)間對(duì)多糖提取量及對(duì)芡實(shí)多糖清除羥自由基效果的影響

稱取2 g粉碎度為40目的芡實(shí)粉，加入60mL的蒸餾水，置于 70℃下分別浸提 1、2、3、4、5和6 h，浸提離心后取上清液濃縮，加入3倍體積的70%乙醇沉淀12 h，加水溶解并測(cè)定多糖提取量及其對(duì)羥自由基的清除率。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)多糖提取量及對(duì)芡實(shí)多糖清除羥自由基效果的影響

由圖2可知，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，芡實(shí)多糖的含量逐漸增加，浸提時(shí)間5 h時(shí)達(dá)到最大，然后隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，芡實(shí)多糖提取量開(kāi)始下降。芡實(shí)多糖清除羥自由基的能力與芡實(shí)多糖提取隨浸提時(shí)間變化的趨勢(shì)相同。故浸提時(shí)間選擇在5 h左右比較適宜。

2.3 乙醇濃度對(duì)多糖提取效果及對(duì)芡實(shí)多糖清除羥自由基效果的影響

稱取2 g粉碎度為40目的芡實(shí)粉，加入60mL的蒸餾水，置于70℃下分別浸提2 h，浸提離心后取上清液濃縮，分別加入3倍體積的50%、60%、70%、80%、90%和100%乙醇沉淀12 h，加水溶解并測(cè)定多糖提取量及其對(duì)羥自由基的清除率。結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著乙醇濃度增加，芡實(shí)多糖的含量逐漸增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)達(dá)到最大，然后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，芡實(shí)多糖提取量開(kāi)始下降。芡實(shí)多糖清除羥自由基的能力隨乙醇濃度變化的趨勢(shì)相同。故乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇在80%左右比較適宜。

圖3 乙醇濃度對(duì)多糖提取量及對(duì)芡實(shí)多糖清除羥自由基效果的影響

2.4 水料比對(duì)多糖提取效果及對(duì)芡實(shí)多糖清除羥自由基效果的影響

稱取2 g粉碎度為40目的芡實(shí)粉，以水料比(mL∶g)為 20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1 加入蒸餾水，置于70℃下浸提2 h，浸提離心后取上清液濃縮，加入3倍體積的70%乙醇沉淀12 h，加水溶解并測(cè)定多糖提取量及其對(duì)羥自由基的清除率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 水料比對(duì)多糖提取量及對(duì)芡實(shí)多糖清除羥自由基效果的影響

從圖4可知，隨著水料比的增加，芡實(shí)多糖的含量逐漸增加，水料比為30∶1時(shí)達(dá)到最大，然后隨著水料比的增大，芡實(shí)多糖提取量開(kāi)始下降。芡實(shí)多糖清除羥自由基的能力隨水料比變化的趨勢(shì)相同。故水料比選擇在30∶1左右比較適宜。

2.5 響應(yīng)面分析

本試驗(yàn)采用Design-Expert7.1.6軟件中的中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取浸提溫度(A)、浸提時(shí)間(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)和水料比(D)4個(gè)因素作為試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，共有19個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中16個(gè)析因點(diǎn)，3個(gè)中心點(diǎn)。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用響應(yīng)面分析法分析正交試驗(yàn)結(jié)果，得到分別以多糖提取量和羥自由基清除率為響應(yīng)值的回歸方程(1)和(2)。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表3和表4。

從表3和表4可知，不論是以多糖提取量為響應(yīng)值還是以羥自由基清除率為響應(yīng)值，建立的數(shù)學(xué)模型均是顯著的，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明建立的該數(shù)學(xué)模型可以很好地?cái)M合試驗(yàn)情況，可用于試驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測(cè)。即可以使用該數(shù)學(xué)模型推測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

表3 響應(yīng)面ANOVA對(duì)多糖提取量分析結(jié)果

表4 響應(yīng)面ANOVA對(duì)芡實(shí)多糖清除羥自由基分析結(jié)果

各因素對(duì)多糖提取量和羥自由基清除效果的影響由大到小依次為:乙醇濃度＞浸提時(shí)間＞水料比＞浸提溫度。其中乙醇濃度對(duì)結(jié)果有非常顯著的影響，其余因素對(duì)結(jié)果影響顯著，浸提溫度和乙醇濃度之間的交互作用及浸提時(shí)間和乙醇濃度之間的交互作用對(duì)結(jié)果有顯著影響，而且浸提溫度和水料比的交互作用對(duì)羥自由基的清除率也有顯著性影響，它們之間的交互作用響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5～圖9。

圖5 浸提溫度與乙醇濃度對(duì)芡實(shí)多糖提取量的影響

圖6 浸提時(shí)間與乙醇濃度對(duì)芡實(shí)多糖提取量的影響

圖7 浸提溫度與乙醇濃度對(duì)芡實(shí)多糖羥自由基清除率的影響

圖9 浸提時(shí)間與水料比對(duì)芡實(shí)多糖羥自由基清除率的影響

由以上數(shù)學(xué)模型得到4個(gè)較優(yōu)的工藝條件(試驗(yàn)1～4)，將這4個(gè)條件和正交試驗(yàn)結(jié)果最佳的兩個(gè)試驗(yàn)條件一起組成驗(yàn)證試驗(yàn)，以尋找芡實(shí)多糖提取的最佳工藝條件。驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)浸提溫度為92℃、浸提時(shí)間為6h、乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、水料比為26∶1(mL∶g)時(shí)，芡實(shí)多糖的提取量達(dá)到最大0.63 mg/g，該條件下得到的芡實(shí)多糖對(duì)羥自由基的清除率也達(dá)到最大46.42%，與理論預(yù)測(cè)值非常接近。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)首先分別考察了浸提溫度、浸提時(shí)間、乙醇濃度、水料比對(duì)芡實(shí)多糖提取量及多糖對(duì)羥自由基清除率的影響，并以此為依據(jù)，采用響應(yīng)面法建立了數(shù)學(xué)模型，并獲得了芡實(shí)多糖的最佳提取工藝條件為:浸提溫度為92℃，浸提時(shí)間為6h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，水料比為26∶1(mL∶g)，此條件下芡實(shí)多糖的提取量為0.63 mg/g，其對(duì)羥基自由基的清除率為46.42%。

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Preliminary Study on Extraction of Crude Polysaccharides from Semen euryales and Its Scavenging Activity of Hydroxyl Radical

Zhao Xuan1，Li Hong-liang2，Ye Qian-wen1
1(The College of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agricultural and Engineering，Guangzhou 510225，China)2(Dongguan Guangyi Food Additive Industry Co，Ltd，Dongwan 523220，China)

The extraction of crude polysaccharides from Semen euryales was studied and the scavenging activity of hydroxyl radical of the polysaccharides was also discussed.The effects of extraction temperature，extraction time，ethanol concentration，liquid to solid ratio on the extraction yield of the crude polysaccharides and the scavenging activity of hydroxyl radical of the polysaccharides were investigated.Single factor experiments and the orthogonal experiments was designed by Design-Expert software.The model was established by the response surface methodology analysis and the optimal extraction condition was obtained as follows:extraction temperature 92℃，extraction time 6h，ethanol concentration 85%，liquid to solid ratio 26∶1，the extraction yield of crude polysaccharides was 0.63mg/g and the scavenging activity of hydroxyl radical was 46.42%.

Semen euryales，polysaccharide，hydroxyl radical，extraction，scavenging activity，response surface methodology

博士，講師。

2010－07－06，改回日期:2010－10－15