單酶和雙酶分步酶解鴨蛋清蛋白的工藝*

吳暉，任堯，李曉鳳

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510640)

單酶和雙酶分步酶解鴨蛋清蛋白的工藝*

吳暉，任堯，李曉鳳

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510640)

探討了單酶及雙酶分步酶解鴨蛋清蛋白制備多肽的工藝和水解效果。在7種不同來源的蛋白酶中，蛋清水解專用蛋白酶、堿性蛋白酶Alcalase AF 2.4L和胰蛋白酶均顯示出了較好的酶解效果，其中以堿性蛋白酶Alcalase AF 2.4L酶解效果最佳，酶解的最佳工藝條件為:底物濃度為50g/L，反應時間4 h，加酶量8.0×104U/g，pH值8.3、60℃，最大水解度為10.0%;而以蛋清水解專用蛋白酶和胰蛋白酶為催化劑時最大水解度分別為8.8%和7.2%。根據(jù)單酶酶解結(jié)果探討了雙酶分步酶解工藝，確定了以“蛋清水解專用蛋白酶-堿性蛋白酶Alcalase AF 2.4L”和“堿性蛋白酶Alcalase AF 2.4L-胰蛋白酶”的雙酶組合較好，鴨蛋清蛋白在酶解8h后水解度可達到26.2%和26.6%，明顯優(yōu)于單酶水解效果。

鴨蛋清蛋白，多肽，雙酶，水解度

鴨蛋清蛋白富含人體所必需的多種氨基酸，且氨基酸組成配比均衡性好。然而，人體對蛋清蛋白的吸收較緩慢，將蛋清蛋白酶解制成蛋清肽，不僅提高了其在機體中的吸收速率，還具有不可替代的調(diào)節(jié)功能和良好的營養(yǎng)特征、生理功能和加工特性等［1－3］。研究表明，蛋清蛋白經(jīng)酶解后所得到的蛋清肽具有抗疲勞、提高免疫力、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性、抗氧化等多種功能活性［4－6］。

目前，禽類蛋清蛋白多肽在酶法制備和活性研究方面已經(jīng)取得了一定進展，但主要集中在雞蛋蛋清肽的制備研究，而以鴨蛋蛋清制備活性蛋白肽的研究較少。此外，由于目前對禽蛋類的加工較為粗放，導致了大量加工副產(chǎn)物蛋清蛋白剩余，造成了大量蛋白質(zhì)的損失和浪費。本文以鴨蛋清蛋白為底物，選擇了7種不同來源的蛋白酶，研究了不同酶解條件下鴨蛋清蛋白的酶解反應的規(guī)律及其效果，并制備出新型蛋白多肽，以期待為鴨蛋清蛋白的開發(fā)利用及其精深加工提供新的參考方案。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

鴨蛋蛋清蛋白，廣州市五山農(nóng)貿(mào)市場;蛋清水解專用蛋白酶(5.0×105U/g)，廣西東恒華道公司;堿性蛋白酶 Alcalase AF 2.4L(1.5 ×105U/g［7］)、胰蛋白酶Trypsin(106U/g)、木瓜蛋白酶Papain(4.0×105U/g)、胃蛋白酶Pepsin(7.0×105U/g)、復合蛋白酶Promamex(9.34 ×105U/g)、風味蛋白酶Flavourzyme(2.7×105U/g)，Novo酶制劑公司;NaOH、HCl等均為分析純試劑。

THZ－92C恒溫水浴鍋，上海博迅有限公司;JB 90－S電動攪拌機，上海標本模型廠;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;Eppendorf AG高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司;pHB-4便攜式pH計，上海精密科學儀器有限公司;CHRIST ALPHA 1-2冷凍干燥機，德國CHRIST公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 鴨蛋清蛋白質(zhì)含量的測定

采用凱氏定氮法測定［8］。

1.2.2 單酶酶解過程

將新鮮干凈的鴨蛋分離出鴨蛋清，用蒸餾水配制成底物蛋白濃度為50g/L的蛋清蛋白溶液，攪拌均勻，95℃，pH10下熱預處理30 min，使其蛋白變性及酶抑制物失活［9］。以1mol/L的HCl溶液將該蛋清蛋白溶液pH值調(diào)至各酶反應所需最適pH值。取一定量的蛋清水解專用蛋白酶，Trypsin，Pepsin，Promamex，F(xiàn)lavourzyme，Papain 及 Alcalase AF 2.4L 分別加入到蛋清蛋白溶液中，混合均勻后放入恒溫振蕩鍋中以150 r/min振蕩反應一定時間，定時取樣測其水解度［10］。在95℃熱處理10 min使酶失活，終止反應，冷至室溫，(10 000×g)離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得到酶解物。篩選最佳酶催化劑時，加酶量為10×104U/g，底物濃度為50g/L，各酶的反應溫度和 pH分別為蛋清水解專用酶(50℃，pH值6.5)，Trypsin(45℃，pH 值 8.0)，Pepsin(37℃，pH 值1.8)，Promamex(50℃，pH 值 6.5)，F(xiàn)lavourzyme(50℃，pH 值 7.0)，Papain(65℃，pH 值 7.0)，Alcalase AF 2.4L(60℃，pH值8.5)。其中，蛋清水解專用蛋白酶、Trypsin、Promamex、Flavourzyme 及 Alcalase 2.4L酶解反應的水解度選用pH-stat法測定;Pepsin、Papain酶解反應的水解度采用甲醛滴定法［11］。鴨蛋清酶解反應水解度計算公式如下:

(1)采用pH-stat法:

B:堿液體積，mL;Nb:堿液的濃度，mol/L;α:α-氨基酸的解離度，α =［10(pH-pK)］/［1+10(pH-pK)］，其中pK為-氨基的平均pK，按7.0計算;pH為反應起始的pH值。MP:底物中蛋白質(zhì)的總量，g;htot:單位質(zhì)量底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)，mmol/g;鴨蛋清蛋白htot=11.1 mmol/g。根據(jù)水解度的計算公式可知，用耗堿量來表征水解度的大小，記錄不同時間下的耗堿量，即可得到酶解進程曲線。

(2)采用甲醛滴定法時

h:采用甲醛滴定法測定的酶解液中的—NH2或—COOH基團的含量，mmol/g;h0:采用甲醛滴定法測定的水解前原料中的—NH2或—COOH基團的含量，mmol/g;htot:每克原料蛋白的肽鍵毫摩爾數(shù)，mmol/g。

1.2.3 單酶催化鴨蛋清蛋白水解工藝的正交試驗設計

本實驗探討5種因素對酶解效果的影響，分別為pH值、溫度、加酶量、底物濃度、反應時間。pH值、溫度不隨其他3因素的改變而變化，為所使用酶的最適pH值和溫度，保持相對穩(wěn)定;而加酶量、底物濃度、反應時間會相互影響水解結(jié)果，故選定其為正交設計試驗的三因素，其正交試驗水平如表1所示。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.4 雙酶酶解鴨蛋清蛋白過程

在單酶解工藝基礎上，選取具有較好催化鴨蛋清蛋白水解活性的酶確定雙酶組合形式，然后先將其中一種蛋白酶加入蛋清蛋白溶液中，根據(jù)1.2.2所述步驟在該酶最佳反應條件下水解一定時間，終止反應后，調(diào)節(jié)反應溫度及pH值至第2種蛋白酶的最適值后加入第二種蛋白酶，水解一定時間后終止反應，得到混合蛋白肽液。定時取樣測得反應水解度。反應混合液冷至室溫，10 000×g離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得到雙酶酶解蛋清蛋白水解物。

2 結(jié)果與討論

2.1 鴨蛋清中的蛋白質(zhì)含量

鴨蛋清蛋白作為反應底物，其濃度是影響酶促反應的重要因素之一?？紤]到不同來源、批次的鴨蛋清蛋白質(zhì)含量有所區(qū)別，本研究首先采用凱氏定氮法分析了所選用鴨蛋清中的蛋白質(zhì)含量。分析結(jié)果表明，該鴨蛋清蛋白質(zhì)含量為9.9%。

2.2 單酶種類對鴨蛋清蛋白水解反應的影響

不同來源的酶具有各自獨特的結(jié)構(gòu)，故其催化活性及專一性皆有所區(qū)別。由表2知，本試驗選取的不同來源的7種酶中，堿性蛋白酶催化鴨蛋清蛋白水解反應的水解度最高，達到10.0%左右，以蛋清水解專用蛋白酶和胰蛋白酶為催化劑時，反應水解度分別達到8.8%和7.2%。其余4種酶的水解度均低于5.0%，如胃蛋白酶的水解度僅達到2.5%。為了進一步提高單酶酶解工藝下鴨蛋清蛋白水解反應的水解度，對堿性蛋白酶、蛋清水解專用蛋白酶和胰蛋白酶催化鴨蛋清蛋白反應的最佳反應條件作了進一步研究。

表2 七種蛋白酶酶解鴨蛋清蛋白的水解度比較

2.3 不同的反應條件對單酶催化鴨蛋清蛋白反應的影響

2.3.1 pH值對鴨蛋清蛋白水解反應影響

pH值是影響酶解反應的重要因素之一。本研究在50℃(蛋清水解專用蛋白酶)、60℃(堿性蛋白酶)、45℃(胰蛋白酶)，加酶量10×104U/g底物蛋白，底物濃度50g/L條件下，改變反應體系pH值，反應6 h后測定酶解反應的水解度。由圖1可知，3種酶的催化能力跟反應體系pH值密切相關，且具有相似的變化曲線，即酶解反應水解度隨pH值增大而增大，蛋清蛋白的水解度提高;超過最佳pH值后繼續(xù)提高反應體系pH值，水解度反而開始減小。蛋清水解專用酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶在催化鴨蛋清蛋白水解反應中的最適pH值分別為7.0、8.3和8.0，反應6h時的水解度分別為9.2%、10.6%、7.8%。

圖1 pH值對鴨蛋清酶解反應的水解度影響

2.3.2 溫度對鴨蛋清蛋白水解反應的影響

在確定的最佳pH值下，選定加酶量為10×104U/g底物蛋白，底物濃度為50g/L，反應6 h，研究反應溫度對3種酶催化鴨蛋清蛋白水解反應的影響。如圖2所示，隨溫度升高，酶促鴨蛋清蛋白水解反應的水解度緩慢提高;當溫度升高到一定值后，水解度開始降低。這是由于升高溫度，酶分子與底物分子之間的有效碰撞頻繁，底物與酶分子之間結(jié)合速度加快，故有利于促進酶反應的進行，但過高的反應溫度也會加劇蛋白酶的失活。蛋清水解專用蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶在此反應中的最適溫度分別為50、60和45℃。

圖2 溫度對鴨蛋清蛋白酶解反應的水解度影響

2.3.3 加酶量對蛋清蛋白水解反應的影響

圖3描述了3種酶在最佳反應溫度及pH值下，底物濃度為50g/L，反應6 h時，加酶量對催化鴨蛋清蛋白水解反應的影響。隨加酶量的增加，水解程度也不斷增大，當加酶量達到8.0×104U/g后水解度的增加趨于平緩，說明反應所需的酶量已飽和，再繼續(xù)添加對水解度影響較小，結(jié)合成本考慮，將加酶量定為8.0×104U/g底物蛋白較好。

圖3 加酶量對鴨蛋清蛋白酶解反應的水解度影響

2.3.4 底物濃度對鴨蛋清蛋白水解反應的影響

為探討底物濃度對酶促水解反應的影響規(guī)律，分別在各酶的最佳溫度和pH值下，加酶量8.0×104U/g，反應6 h的條件下進行酶促鴨蛋清水解反應。圖4表明，隨著底物濃度的增大，反應水解度不斷增大;當?shù)孜餄舛葹?0g/L時，3種酶催化反應水解度達到最大值，分別為8.8%、10.0%、7.2%;之后隨著底物濃度的增大反應水解度緩慢減小，可能是由于隨底物濃度的增大，蛋清蛋白局部過剩，不能充分與酶接觸，進而影響了酶對蛋清蛋白的水解作用。因此3種酶催化蛋清蛋白水解的最適底物濃度為50g/L。

圖4 底物濃度對蛋清蛋白酶解反應的水解度影響

2.3.5 水解時間對鴨蛋清蛋白水解反應的影響

圖5顯示了鴨蛋清蛋白水解度隨反應時間的變化規(guī)律，可以看出，在pH值、溫度、加酶量、底物濃度確定后，3種酶催化的鴨蛋清酶解反應的水解度都隨時間的增加而迅速升高;反應4h后水解度的增加均趨于平緩，其原因可能是隨著水解的進行，蛋白質(zhì)中能被水解的特異性肽鍵數(shù)目不斷減少，且酶的活性逐漸降低，從而使得水解反應的速度逐漸下降。

圖5 鴨蛋清蛋白水解反應時間曲線圖

2.4 單酶催化鴨蛋清蛋白水解反應的正交實驗研究

表3用正交實驗分析研究了3種酶在3因素3水平下催化水解蛋清蛋白的工藝條件。表中的R值說明了3因素:對水解度的影響程度，底物濃度和反應時間對結(jié)果影響相對較顯著，而加酶量對水解度的影響相對較小，可能是由于表中加酶量的3水平值即將接近飽和，所以對水解結(jié)果影響不大。3個因素對實驗的影響主次順序都是底物濃度＞酶解時間＞加酶量。

表3 三種酶的正交試驗直觀分析表L9(33)

2.5 鴨蛋清蛋白雙酶酶解工藝研究

將單酶中水解效果較好的3種酶:蛋清水解專用蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶兩兩組合，在已經(jīng)確定的單酶各自最佳催化條件下水解蛋清蛋白，一定時間內(nèi)分別測出其水解度。

將3種酶兩兩組合，確定了3種組合方式，即“蛋清水解專用蛋白酶-胰蛋白酶”、“蛋清水解專用蛋白酶-堿性蛋白酶”以及“堿性蛋白酶-胰蛋白酶”，進行雙酶催化鴨蛋清蛋白水解工藝的研究。由圖6可知，3種酶的兩兩組合均顯著提高了蛋清蛋白水解反應的水解度。第1種蛋白酶作用底物一定時間，反應水解度基本達到單酶的最大水解度，再加入第2種蛋白酶，隨著第2種酶的加入，蛋白水解度開始迅速增大。對“蛋清水解專用蛋白酶-胰蛋白酶”組而言，當反應達到6h時，水解度達到18.0%，之后水解度逐漸趨于平緩;采用“蛋清水解專用蛋白酶-堿性蛋白酶”和“堿性蛋白酶-胰蛋白酶”組合時，隨反應時間的增加，水解度不斷增大，反應到8h時水解度分別達到26.2%和26.6%，繼續(xù)延長反應時間，反應曲線趨于平緩。可見，3組雙酶組合，反應最佳時間分別為:6h、8h、8h，反應最大水解度分別為:18.0%、26.2%、26.6%，且加入的第2種酶的催化能力均比第1種強，每條曲線出現(xiàn)拐點，呈“S”形，這種現(xiàn)象可能是由于底物蛋白經(jīng)過第1種酶的催化水解后，大量蛋白內(nèi)部肽段暴露出來，加速了第2種酶的催化水解作用。同時，采用2種酶分步加入的方式，也大大增加了反應中可被水解的肽鍵種類和數(shù)量，提高了反應的肽得率。

圖6 雙酶催化鴨蛋清蛋白水解反應時間曲線

3 結(jié)論

以鴨蛋清蛋白為原料，探討了水解蛋清蛋白的酶解工藝，確定了3種水解效果較好的單酶:蛋清水解專用酶、堿性蛋白酶Alcalase AF 2.4L以及胰蛋白酶;3者的最佳水解條件分別為:底物濃度均為50g/L，加酶量均為8.0×104U/g底物蛋白，pH值:7.0、8.3、8.0，溫度:50、60、45℃;蛋清水解專用蛋白酶、堿性蛋白酶Alcalase AF 2.4 L水解鴨蛋清蛋白4h，或胰蛋白酶水解鴨蛋清蛋白5h，反應可達到最大水解度，分別為:8.8%、10.0%、7.2%。對雙酶分步酶解鴨蛋清蛋白工藝的研究表明，由“蛋清水解專用蛋白酶-堿性蛋白酶Alcalase AF 2.4 L”、“堿性蛋白酶Alcalase AF 2.4 L-胰蛋白酶”組成的雙酶分步水解工藝效果較佳，反應8 h后水解度可分別達到26.2%和26.6%。此時，產(chǎn)物肽具有輕微苦味，直接應用會影響口感，在后續(xù)試驗中有待進一步探討解決。

蛋清蛋白酶解得到的降解產(chǎn)物具有降血壓、抗疲勞、抗氧化等多種生理活性，且易被人體吸收。本研究不僅可將大量廉價的鴨蛋清充分利用，提高其經(jīng)濟附加值，而且為酶解蛋白制備活性肽提供了一條新穎的思路，所制備的多肽產(chǎn)物具有廣闊的應用前景。

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Preparation of Bioactive Peptides via Hydrolysis of Duck Egg-white Protein by Single/Binary Enzymes

Wu Hui，Ren Yao，Li Xiao-feng
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

The hydrolysis of duck egg-white protein was investigated for preparation of peptides using single and binary-enzymes.Seven kinds of proteases were tested for the hydrolysis of egg-white protein，among which Alcalase AF 2.4L showed the highest catalytic capability.Besides，the egg-white protein-specific protease(SEEP)and trypsin also exhibited high activities in the hydrolysis reaction.By single-factor and orthogonal tests，the optimal conditions for egg white protein hydrolysis were determined as follows:substrate concentration 50g/L，reaction time 4 hours，enzyme dosage 8.0 ×104U/g，pH value 8.3，and reaction temperature 60℃，under which the DH values of hydrolysis reactions catalyzed by Alcalase AF 2.4L，SEEP and trypsin were 10.0%，8.8%and 7.2%，respectively.According to the single-enzyme catalyzed hydrolysis，the most suitable binary combinations of proteases were determined as SEEPAlcalase AF 2.4L and Alcalase AF 2.4L-trypsin.It was found that the degrees of hydrolysis were significantly improved by using SEEP-Alcalase AF 2.4L and Alcalase AF 2.4L-trypsin，being of 26.2%and 26.6%，respectively.

duck egg-white protein，peptide，binary-enzymes，the degree of hydrolysis

博士(李曉鳳為通訊作者)。

*新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET－060746);教育部高校博士點基金資助項目(200805611022)

2010－05－08，改回日期:2010－09－02