脈沖強磁場對牛奶中酶活性的影響*

陳仁菊，郭丹丹，肖凱軍

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州，510640)

脈沖強磁場對牛奶中酶活性的影響*

陳仁菊，郭丹丹，肖凱軍

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州，510640)

研究了脈沖強磁場對牛乳中過氧化物酶、脂肪酶、過氧化氫酶的鈍化效果。結果表明，脈沖強磁場對以上3種酶均有很好的鈍化效果，且鈍化作用的順序由強到弱為:過氧化氫酶＞脂肪酶＞乳過氧化物酶;當磁場強度在8.01～18.69T、脈沖數(shù)在0～10內，以上3種酶的失活率最大值分別為:乳過氧化物酶47.5%，脂肪酶53.6%，過氧化氫酶90.3%。通過二元回歸分析的方法建立了以磁場強度、脈沖數(shù)為影響因素的，與酶失活率相關的回歸方程，并檢驗了模型的可靠性，結果表明:脈沖數(shù)和脈沖磁場強度對以上3種酶的鈍化效果都存在顯著影響，而且脈沖磁場的強度和脈沖數(shù)對牛乳中脂肪酶的鈍化效果存在一定的協(xié)同效應。文中提供了一種牛乳預處理的新技術，并初步探討了脈沖強磁場對牛乳中酶的鈍化機理，為脈沖強磁場在液體食品中殺菌以及鈍酶方面的研究以及工業(yè)化生產提供了很好的理論依據。

脈沖強磁場，牛奶，乳過氧化物酶，脂肪酶，過氧化氫酶

傳統(tǒng)上往往通過熱處理的方法殺滅牛奶中的微生物和鈍化部分酶以達到優(yōu)化乳品感官及質量。但熱處理容易對牛奶的品質造成一定影響，如產生蒸煮味等，而且會破壞牛奶中的營養(yǎng)成分［1］。低溫下牛奶滅酶技術彌補了熱處理的不足，成為國內外學者研究的熱點。脈沖磁場技術是利用高強度磁場發(fā)生器向螺旋線圈發(fā)出強脈沖磁場，將食品放置于螺旋線圈內部的磁場當中，微生物受到強脈沖磁場的作用會死亡，該技術具有保護食品的組織結構、營養(yǎng)成分和顏色不受破壞，保持食品原有風味的優(yōu)點［2］，目前已在液態(tài)食品殺菌、鈍化酶活力、提高果汁出汁率等方面得到了廣泛研究［3］。馬海樂等［4－5］曾對脈沖磁場對辣根過氧化物酶活性的影響、草莓汁過氧化物酶活性的影響進行研究，結果表明低強度脈沖磁場對過氧化氫酶有激活作用，高強度磁場對過氧化氫酶有抑制作用。

本文主要研究脈沖強磁場感應強度在8T以上，10個脈沖以內的處理條件下處理牛奶，了解其中的乳過氧化物酶、脂肪酶、過氧化氫酶的鈍化作用。并通過回歸分析方法建立數(shù)學模型，進一步分析了脈沖強磁場強度及脈沖數(shù)對牛乳中3種酶的活性的影響。

1 材料與設備

1.1 實驗材料

牛奶，購自華南農業(yè)大學牛奶場，于4℃下冷藏。其他化學試劑主要購自天津化學試劑廠和廣州化學試劑廠，所用化學試劑均為分析純。

1.2 實驗裝置

HSM－S20型脈沖強磁場裝置，武漢強磁場中心。

2 實驗方法

2.1 牛奶中粗制酶液的提取

將牛奶于4℃，7 000 r/min下離心10 min，除去乳脂肪，再經抽濾除去大的脂肪球。將濾液用磷酸調節(jié)pH至4.6，混合均勻，沉淀酪蛋白，然后用雙層紗布過濾，濾液置于高速冷凍離心機中，4℃，8 000 r/min離心15 min，上清液用0.5mol/L的NaOH溶液調pH值至6.0，即得到粗制酶液，于4℃下保存［6］。雖然樣品中含有部分乳清蛋白會影響酶測定的準確性，但目前關于牛乳中酶的測定中大多數(shù)以此方法制備樣品，改進后的樣品制備方法是先通過離心去掉乳清，再將得到的酶蛋白的膠粒進行一定的處理后測定。但由于酶是存在于牛乳中才能更好地發(fā)揮作用，因此張愛霞［10］等人認為傳統(tǒng)制備樣品的方法更利于實際研究。

2.2 脈沖強磁場處理粗制酶液

將粗制酶液分裝入不同試管中，蓋上塞子，室溫放置1 h，標號，并對粗制酶液分別進行脈沖強磁場處理。選擇磁場強度和脈沖數(shù)作為影響因素，磁場強度分別為:8.01T、10.68T、13.35T、16.02T、18.69T(對應的電壓分別為 3、4、5、6、7 kV)，每個磁場強度分別設置2、4、6、8、10五個水平的脈沖數(shù)，共25組試驗。脈沖寬度為10 ms，脈沖之間的間隔為15 s。

2.3 乳過氧化物酶活性的測定

2.3.1 溶液的配制

(1)磷酸鹽緩沖液(pH值7.0):用0.2mol/L的Na2HPO4溶液將100mL，0.2mol/L KH2PO4溶液的pH值調至7.0。

(2)過氧化氫溶液:用蒸餾水將1.0mL過氧化氫(30%H2O2)定容至100mL，取出1.0mL，并用磷酸緩沖液將它稀釋至50mL。

(3)4-氨基安替比林溶液:取810 mg苯酚溶于40mL蒸餾水中，加25 mg 4-氨基安替比林，溶解，用蒸餾水定容至50mL。

2.3.2 過氧化物酶活性的測定

采用沃辛通法測定過氧化物酶活性［7］。將1.4mL 4-氨基安替比林溶液和1.5mL過氧化氫溶液滴入一只1cm比色皿，并調溫至25℃。加0.10mL酶溶液，混合，按動秒表，用紫外可見分光光度計(510 nm)以蒸餾水為參比測定吸光度(在5 min內每隔1 min測1次)，直至每分鐘內吸光度的增大值達到穩(wěn)定為止。

乳過氧化物酶活力的計算:1個乳過氧化物酶單位相當于在規(guī)定條件下，于25℃，pH7.0時，每分鐘分解1 mol H2O2時所需的酶量。計算公式為:

式中:酶活力單位為U/mg。E510為510 nm處每分鐘吸光度的增大值;3為反應混合液的總體積;EW為每0.1mL所用酶液中含酶的質量(mg);6.58為1個單位能在1 min內使吸光度增大6.58。

2.4 脂肪酶活性的測定

脂肪酶活性的測定參考張瑞宇等的方法［8］。制作底物溶液:稱取聚乙烯醇(PVA)40 g，加水800mL，在沸水浴中加熱，攪拌，直至全部溶解，冷卻后定容至1 000mL。以干凈的雙層紗布過濾，濾液即為4%的PVA溶液。量取4%PVA溶液150mL，加橄欖油50mL，用均質機處理6 min(分2次處理，每次3 min，中間停5 min)，即成乳白色PVA乳化液。溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如貯存在冰箱中，有效期為1周。

測試脂肪酶活性:取2個100mL三角瓶，分別于空白瓶和樣品瓶中各添加4mL底物溶液和5mL磷酸緩沖液(pH=7.5，0.025mol/L)，再于空白瓶中加入15mL 95%乙醇，將2瓶置于(40±0.2)℃水浴預熱5 min，各加入待測酶液1mL，立刻混勻，計時，在(40±0.2)℃水浴中準確反應15 min，在樣品瓶中補加15mL 95%乙醇終止反應，取出。在空白瓶和樣品瓶中各加1%酚酞指示劑3滴，用0.01mol/L NaPH標準溶液滴定，直至微紅色并保持30 s不褪色，即為終點。記錄消耗NaPH標準溶液的體積。計算公式為:

式中:X為樣品的酶活力，u/g;B為樣品滴定時消耗的NaOH標準溶液的體積，mL;A為空白滴定時消耗NaOH標準溶液的體積，mL;c為NaOH標準溶液的濃度，mol/L;0.05為NaOH標準溶液濃度換算系數(shù);50為0.05mol/L NaOH溶液1.00mL相當于脂肪酸50 μmol;1/15為反應時間15 min，以1 min計;n為稀釋倍數(shù)。

2.5 過氧化氫酶活性的測定

用碘量滴定法測定過氧化氫酶的活性［9］。

淀粉指示劑:取0.3 g可溶性淀粉與少量水混合，倒入沸水中，冷卻后加0.1 g KI和0.1 g Na2CO3，用水稀釋至50mL。

將0.1mL 30%H2O2用 0.01mol/L、pH6.8的磷酸緩沖液稀釋至100mL，即得到測定過氧化氫酶的底物溶液。取5mL底物溶液于100mL的碘量瓶中，置于25℃水浴中保溫。向其中加入1mL粗制酶液，立刻計時，混勻。3 min后立即加入2mL 0.5mol/L的H2SO4滅酶。再加入1mL 10%的KI和2滴1%的鉬酸銨溶液，放置3 min后，用0.01mol/L的硫代硫酸鈉溶液滴定，待反應液呈淺黃色時，加2～3滴淀粉碘化鉀指示劑，繼續(xù)滴定至藍色消失為止。記錄硫代硫酸鈉溶液消耗的體積(mL)。對照先加H2SO4后加酶液，其余步驟與上述操作相同，記錄消耗硫代硫酸鈉溶液的體積(mL)。

本實驗條件下，每分鐘催化分解1μg H2O2的酶量定義為1個活力單位。絕對酶活力(U/mL或U/g)的計算公式為:

式中:A為空白消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，mL;B為樣品消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，mL;c為硫代硫酸鈉溶液的濃度，mol/L;1 000為硫代硫酸鈉溶液的摩爾數(shù)折合成微摩爾數(shù);3為反應3時間，min;n為酶液的稀釋倍數(shù)。

2.6 脈沖強磁場對牛奶中酶作用的評價

脈沖強磁場對牛奶中酶活性的影響用酶失活率進行評價。酶失活率的計算公式為:

2.7 數(shù)學模型驗證

用Excel軟件進行二元回歸分析，建立與酶的失活率相關的脈沖數(shù)和脈沖磁場強度的二元回歸方程。其中脈沖磁場的強度分別為:8.01T、10.68T、13.35T、16.02T、18.69T;脈沖數(shù)分別為:2、4、6、8、10。通過對回歸系數(shù)的顯著性水平P值以及方程的復相關系數(shù)R值等的分析，進一步分析模型的準確性。以得出在實際應用中控制酶失活率在一定范圍內時，脈沖磁場強度與脈沖數(shù)的最佳參數(shù)設定。

3 結果與分析

3.1 脈沖強磁場對牛奶中過氧化物酶的作用

3.1.1 磁場強度對牛奶中乳過氧化物酶活性的影響

由圖1可以看出，脈沖強磁場的磁場強度對牛奶中乳過氧化物酶活性的影響趨勢。整體來看，隨著磁場強度的增大，脈沖磁場對牛奶中乳過氧化物酶的鈍化作用呈線性不斷增強。而且結合圖2分析可以得出，隨著脈沖數(shù)的增多，脈沖磁場對乳過氧化物酶的鈍化效率不斷提高。而且當脈沖數(shù)為10，磁場強度在8.01～13.35T，乳過氧化物酶的失活率升高最快，當磁場強度高于13.35T，乳過氧化物酶的失活率變化趨勢又趨于平緩。

圖1 磁場強度對牛奶中乳過氧化物酶活性的影響

這個趨勢與高夢祥等人關于在脈沖強磁場對酶的鈍化效果方面的實驗結果是一致的［1，4］。隨著磁場強度的增強和脈沖數(shù)的增多，鈍化作用越來越強，這種趨勢也適用于下文各部分的分析。關于脈沖磁場對酶的作用效果的機理解釋目前仍無定論，賀華君等人［11］認為是脈沖強磁場改變了酶的活性中心立體構象從而導致酶失活。

3.1.2 脈沖數(shù)對牛奶中乳過氧化物酶的作用

由圖2可以看出，脈沖數(shù)對牛奶中乳過氧化物酶活性的影響總體趨勢為，隨著脈沖數(shù)的增加，脈沖磁場對乳過氧化物酶的鈍化作用不斷增強。當磁場強度為18.69T時，僅需2個脈沖，乳過氧化物酶的失活率即可達到26.5%，但4個脈沖以后，乳過氧化物酶的失活率的變化又趨于平緩，當脈沖數(shù)達到10時，乳過氧化物酶的失活率可達到47.5%。這可能是由于酶活性在較高場強下，隨脈沖數(shù)的增多，鈍化作用效果的增強受到一定的抑制而變得不那么明顯。

圖2 脈沖數(shù)對牛奶中乳過氧化物酶活性的影響

整體來看，在脈沖數(shù)為10，磁場強度在8.01～13.35T，脈沖強磁場對過氧化物酶的作用效果十分穩(wěn)定。有必要通過增加脈沖數(shù)和感應強度來進一步研究脈沖磁場對過氧化氫物酶的鈍化作用。

3.2 脈沖強磁場對牛奶中脂肪酶的作用

3.2.1 磁場強度對牛奶中脂肪酶的作用

圖3中表示脈沖強磁場的磁場強度對牛奶中脂肪酶活性的影響趨勢，可以看出，隨著磁場強度的增大，脈沖磁場對牛奶中脂肪酶的鈍化作用不斷增強。在2個脈沖條件下，脂肪酶的失活率隨磁場強度增大的變化趨勢最為平緩，但不穩(wěn)定。6個脈沖條件下，隨著磁場強度的增大，脂肪酶的失活率升高趨勢比2個脈沖條件下的升高趨勢明顯，脂肪酶的失活率由8.01T時的13.4%升高到18.69T時的53.6%。10個脈沖條件下，脂肪酶的失活率變化趨勢較為平滑，基本呈線性，比6個脈沖條件下脂肪酶的失活率變化幅度略有減小。牛乳中脂肪酶失活隨脈沖數(shù)和磁場強度的變化呈現(xiàn)一定的波動性，這是因為這兩個因素對脂肪酶的鈍化效果可能存在一定的協(xié)同效應，這在下文4.3部分的二元回歸分析中得到了證實。

圖3 磁場強度對牛奶中脂肪酶活性的影響

3.2.2 脈沖數(shù)對牛奶中脂肪酶的作用

由圖4可以看出，脈沖數(shù)對牛奶中脂肪酶活性的影響總體趨勢為，隨著脈沖數(shù)的增加，脈沖磁場對脂肪酶的鈍化作用不斷增強。在磁場強度為8.01T時，脂肪酶的失活率隨脈沖數(shù)的增多而升高的趨勢最為平緩，10個脈沖時的失活率為13.4%。磁場強度為13.35T的條件下，脂肪酶的失活率隨脈沖數(shù)增多而升高的趨勢居中，脈沖數(shù)較小時變化幅度較大，脈沖數(shù)增大，變化趨勢有所平緩。當磁場強度為18.69T時，僅需2個脈沖，脂肪酶的失活率即可達到28.8%，但隨著脈沖數(shù)的增加，脂肪酶的失活率的變化又趨于平緩。

圖4 脈沖數(shù)對牛奶中脂肪酶活性的影響

分析圖4和圖5得出，脂肪酶失活率的變化隨脈沖數(shù)的增多而呈現(xiàn)出一定的波動性，在脈沖數(shù)為10時，隨磁場強度的增強，脂肪酶的鈍化效果比較均勻;而且在脈沖數(shù)為10，磁場強度為18.69T時，牛乳中脂肪酶的失活率可達到90%以上。

3.3 脈沖強磁場對牛奶中過氧化氫酶的作用

3.3.1 磁場強度對牛奶中過氧化氫酶的作用

由圖5可以看出，隨著磁場強度的增大，牛奶中過氧化氫酶的失活率提高。在2個脈沖條件下，過氧化氫酶的失活率磁場強度升高的變化幅度最小，過氧化氫酶的失活率僅由8.01T的12.1%提高到18.9T的45.2%。6個脈沖時，過氧化氫酶的失活率隨磁場強度升高的變化幅度大于2個脈沖條件下過氧化氫酶失活率的變化幅度。而10個脈沖條件下，過氧化氫酶的失活率隨磁場強度升高的變化幅度最為明顯，由8.01T的29.7%%升高到18.9T時的90.3%。

圖5 磁場強度對牛奶中過氧化氫酶活性的影響

3.3.2 脈沖數(shù)對牛奶中過氧化氫酶的作用

圖6表示脈沖強磁場的脈沖數(shù)對牛奶中過氧化氫酶活性的影響趨勢，整體來看，隨著脈沖數(shù)的增大，牛奶中過氧化氫酶的失活率不斷提高。在8.01T的磁場強度時，過氧化氫酶的失活率隨脈沖數(shù)升高的變化幅度最小。當磁場強度為13.35T時，過氧化氫酶的失活率隨脈沖數(shù)增多的變化幅度大于8.01T磁場強度條件下過氧化氫酶失活率的變化幅度。而當脈沖磁場的磁場強度為18.69T時，過氧化氫酶的失活率隨磁場強度升高的變化幅度最為明顯，變化幅度均大于8.01T和13.35T時的過氧化氫酶失活率的變化幅度。

圖6 脈沖數(shù)對牛奶中過氧化氫酶活性的影響

通過圖5和圖6的分析可以得出，在脈沖數(shù)為8時，隨著磁場場強度的增強，牛奶中過氧化氫酶的失活率比較均勻，而且在磁場強度為13.35時，失活率就可以達到50%左右。這可以作為生產中的重要依據。

4 二元回歸分析模型的建立

令Yn為對應的酶的失活率，X1為脈沖數(shù)，X2為脈沖磁場強度。

4.1 磁場強度和脈沖數(shù)對牛乳中過氧化物酶的鈍化效果的二元回歸分析

牛乳中過氧化物酶失活率

其中方差分析結果如表1所示。

表1 過氧化物酶失活率的回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗

由方差分析的結果可以看出，顯著性水平P值均為0，說明脈沖強磁場的強度和脈沖數(shù)對過氧化物酶的鈍化效果的影響均非常顯著。而回歸模型方差分析結果如表2所示。

表2 過氧化物酶失活率回歸模型方差分析

F＞F0.05，說明方程顯著。R=0.97，說明此模型與真實值符合程度達到97%，非常接近準確值，說明可以用此模型來分析脈沖強磁場處理后，過氧化物酶失活率對應的脈沖磁場強度和脈沖數(shù)。

4.2 磁場強度和脈沖數(shù)對牛乳中過氧化氫酶的鈍化效果二元回歸分析

牛乳中過氧化氫酶失活率用下列函數(shù)表示:Y2=－15.03+3.86X1+2.66X2。

各因素對過氧化氫酶的失活率的影響顯著程度見表3。

表3 過氧化氫酶失活率的回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗

分析方法見4.1。其中脈沖數(shù)對乳過氧化氫酶的影響系數(shù)為3.86，影響程度大于磁場的強度(系數(shù)2.66)。

表4 過氧化氫酶失活率回歸模型方差分析

F＞F0.05，說明方程顯著。R=0.72，說明此模型與真實值符合程度達到72%，但仍可以用此模型來初步預測脈沖強磁場處理后，過氧化氫酶失活率對應的脈沖磁場強度和脈沖數(shù)。

4.3 磁場強度和脈沖數(shù)對牛乳中脂肪酶的鈍化效果的二元回歸分析

牛乳中脂肪酶的失活率可用以下函數(shù)表示:Y3=－26.14+3.58X1－0.26X12+1.91X2+0.025X22+0.15X1X2。分析結果如表5所示。

表5 脂肪酶失活率的回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗

分析方法參考4.1。這個模型與4.1不同之處在于引入了X1X2以及X12和X22三個變量值，目的主要在于分析脈沖數(shù)與脈沖磁場強度對乳脂肪酶是否存在協(xié)同作用效果。由表5可知，X1X2項的P值為0.001＜0.05，說明脈沖婁和磁場強度牛乳中脂肪酶的鈍化作用存在顯著的協(xié)同效應，但系數(shù)是0.15，說明協(xié)同作用的效果不是十分明顯。而X2對應的P值為0.4＞0.1，說明這個變量對模型的影響不是十分顯著，可以剔除，因此，修正后牛乳中脂肪酶失活率的回歸模型用下列函數(shù)表示:Y3=－26.14+3.58X1－0.26X12+1.91X2+0.15X1X2。

F＞F0.05，說明方程顯著。R=0.72，說明此模型與真實值符合程度達到99.4%，完全可以認定為準確值，因此可用此模型來分析脈沖強磁場處理后，脂肪酶失活率對應的脈沖磁場強度和脈沖數(shù)。

表6 脂肪酶失活率回歸模型方差分析

綜合以上回歸模型的分析可以得出，脈沖強磁場對本文中3種酶鈍化作用強弱的順序為:過氧化氫酶＞脂肪酶＞過氧化物酶。

5 結論與討論

(1)脈沖強磁場對乳過氧化物酶、脂肪酶鈍化作用的變化規(guī)律用數(shù)學模型來表示分別為:Y1=－29.7+1.72X1+3.02X2，Y2=－15.03+3.86X1+2.66X2，Y3= －26.14+3.58X1－0.26X12+1.91X2+0.15X1X2。脈沖強磁場對過氧化物酶和過氧化氫酶的鈍化作用效果的回歸模型呈線性分布，而對于牛乳中脂肪酶，脈沖磁場強度與脈沖數(shù)存在顯著的協(xié)同效應，呈二次分布。脈沖強磁場對牛奶中乳過氧化物酶、脂肪酶、過氧化氫酶均有顯著的鈍化作用，且脈沖強磁場對3種酶鈍化作用強弱的順序為:過氧化氫酶＞脂肪酶＞乳過氧化物酶。脈沖磁場對不同酶的作用效果的差異性也間接說明了其作用機理的復雜性。

(2)磁場強度在8.01～18.69T、脈沖數(shù)在0～10，對牛奶中乳過氧化物酶的失活率可達到47.5%，對脂肪酶的失活率可達到53.6%，對過氧化氫酶的失活率可以達到90.3%。綜合考慮實際生產的需要以及工藝的可行性，可以根據以上二元回歸分析的函數(shù)建立方程組來解出所需參數(shù)。隨著技術的進步以及研究的進一步深入，流動條件下通過脈沖強磁場對牛乳進行預處理，達到鈍化牛乳中各種酶的活性，殺滅有害微生物以提高牛乳保質期和保持牛乳的感官品品質有良好的工業(yè)前景。

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Effect of Pulsed High Magnetic Field on the Enzyme Activity of Milk

Chen Ren-ju，Guo Dan-dan，Xiao Kai-jun
(South China University of Technology，College of Light Industry and Food sciences，Guangzhou 510640，China)

The effect of Pulsed High Magnetic Field(PHMF)on milk peroxidase，lipase，catalase of milk was studied in this paper.And the results showed that:PHMF has great effect on the inactivation of enzymes mentioned above，and the order of the inactivation effect on the three enzymes was:Catalase＞ Lipase＞ milk peroxidase.The max inactivation rate of milk peroxidase，Lipase and Catalase is 47.5%，53.6%and 90.3%respectively under the condition o8.01T～18.69T magnetic field intensity，0～10 pulsed numbers.Regression equations about the enzyme inactivation effect were set up through the binary regression analysis method.The influencing factors of these models were magnetic field intensity and pulse count.The reliability of the models were tested.The results showed the following:the magnetic field intensity and pulse numbers have significant influence on the enzymes mentioned above，and more over，these factors have synergy effect on lipase.This paper provided a new method for milk pretreatment，and discussed the mechanism of PHMF on enzymes in milk.The research of this paper has important significance for the liquid food sterilization and enzyme inactivation.It also provides a theoretical basis in the related field of industrialized production.

pulsed high magnetic field，inactivation，milk peroxidase，lipase，catalase

碩士研究生。

*國家863計劃項目(編號:2007AA100405)，項目介紹:課題名稱為食品非熱加工技術與設備，屬于農業(yè)生物制造與食品精細加工技術及產品項目

2010－07－26，改回日期:2010－09－06