從植物乳桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中分離純化γ-氨基丁酸的工藝研究*

張術(shù)聰，劉婷婷，楊套偉，夏海鋒，饒志明

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫，214122)

從植物乳桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中分離純化γ-氨基丁酸的工藝研究*

張術(shù)聰，劉婷婷，楊套偉，夏海鋒，饒志明

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫，214122)

前期篩選獲得1株高效轉(zhuǎn)化L-谷氨酸為γ-氨基丁酸(GABA)的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)GB01－21，該菌以濃度200g/L的L-谷氨酸為底物，發(fā)酵20 h左右，能以99%的摩爾轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)γ-氨基丁酸，產(chǎn)物γ-氨基丁酸的終濃度可達(dá)140g/L左右。從全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中分離純化γ-氨基丁酸，著重對(duì)脫色工藝進(jìn)行了研究，考察了溫度、時(shí)間、pH和活性炭添加量對(duì)脫色效果的影響。通過單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上的正交實(shí)驗(yàn)分析，確定了脫色最佳工藝條件為粉末活性炭(150～200目)用量為1.5%，脫色溫度70℃，pH值4.0，脫色時(shí)間40 min，γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)化液的脫色率高達(dá)98.42%，γ-氨基丁酸的保留率可達(dá)97.23%。隨后對(duì)γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)化液進(jìn)行初步分離純化，最終測得γ-氨基丁酸的回收率89.4%，純度為96.7%。

γ-氨基丁酸，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，脫色，分離純化

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，具有降低血壓、促進(jìn)生殖、活化肝腎等多種生理功能，在食品及醫(yī)藥方面具有廣泛的應(yīng)用前景［1］。生物發(fā)酵法合成γ-氨基丁酸具有條件溫和，對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，已受到國內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛重視［2］，但其發(fā)酵液是個(gè)極其復(fù)雜的多相體系，含有微生物細(xì)胞、代謝產(chǎn)物以及未耗盡的培養(yǎng)基等，給GABA的下游分離純化帶來一定困難，這也成為目前工業(yè)化生產(chǎn)GABA的瓶頸問題。

目前，只有日本實(shí)現(xiàn)了生物合成GABA的工業(yè)化生產(chǎn)，國內(nèi)雖有多家研究機(jī)構(gòu)對(duì)發(fā)酵法制備GABA技術(shù)進(jìn)行研究，但GABA提取效率或純度比較低，而且成本較高［3－5］。由此可見，如何低成本、高效率地對(duì)GABA純化提取已成為工業(yè)化生產(chǎn)γ-氨基丁酸的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選出1株高產(chǎn)GABA的菌株——植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)GB01－21，利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)GABA，摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%(已申請(qǐng)國家發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枮?00910183478.1)，且轉(zhuǎn)化液成分較為單一，有效避免了由發(fā)酵液成分復(fù)雜給下游提取造成的不利影響，但同時(shí)也存在轉(zhuǎn)化液顏色較深等問題。本研究主要對(duì)轉(zhuǎn)化液脫色工藝條件進(jìn)行了研究，并在脫色的基礎(chǔ)上對(duì)γ-氨基丁酸進(jìn)一步分離提取，從而獲得了高回收率、高純度的γ-氨基丁酸，為工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)GB01－21，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基［6－7］

活化培養(yǎng)基(g/L):酪蛋白胨10，牛肉提取物10，酵母提取物5，葡萄糖5，乙酸鈉5，檸檬酸二胺0.2，吐溫－80 0.1，K2HPO40.2，MgSO40.2，MnSO40.05，CaCO320，pH 值6.5，0.08 MPa 滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖10，丁二酸鈉5，pH 6.5，0.08 MPa 滅菌 15 min。

1.3 主要試劑和儀器

GABA標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)，丹磺酰氯(Dns-Cl)、活性炭顆粒炭A、顆粒炭 B、粉末炭 C，NaHCO3、L-谷氨酸(L-Glu)、無水乙醇、冰乙酸、乙酸鈉(均為國藥分析純);實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

PHS-3C型精密 pH計(jì)，Mettler公司;UltiMate-3000型高效液相色譜儀，戴安公司;UV-2000紫外-可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分離工藝流程

GABA分離純化的工藝流程為［8］:

1.4.2 菌體培養(yǎng)

將斜面保藏的菌種接種至活化培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，再以2%的接種量接入種子培養(yǎng)基，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.4.3 轉(zhuǎn)化液的制備

離心收集菌體，用雙蒸水洗滌菌體3次，最后用3 L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.8，0.1mol/L)懸浮菌體，加入200 g L-Glu，30℃下，在5L發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化24 h。

1.4.4 轉(zhuǎn)化液預(yù)處理

收集轉(zhuǎn)化液，離心取上清，在70～80℃加熱30 min，經(jīng)單層濾紙過濾后再用0.45 μm濾膜進(jìn)行抽濾，收集濾液4℃保藏備用。

1.4.5 活性炭預(yù)處理［9］

試驗(yàn)用活性炭經(jīng)驗(yàn)，熱去離子水洗，濾干、干燥(120℃干燥6～8 h)，冷卻到室溫備用。

1.4.6 真空抽濾及結(jié)晶

活性炭脫色后，經(jīng)雙層濾紙過濾后用0.45 μm濾膜進(jìn)行抽濾，收集濾液于55℃進(jìn)行真空濃縮至稀稠狀，加入3倍體積的95%的乙醇結(jié)晶，4℃下靜置12 h，過濾收集晶體。

1.5 測定方法

1.5.1 GABA和L-Glu 的測定方法［10－11］

采用HPLC法測定GABA及L-Glu:Agilent TC C18柱(250 mm ×4.6 mm);進(jìn)樣量:10μL;紫外檢測波長:254 nm;柱溫:室溫;流動(dòng)相A:甲醇;流動(dòng)相B:四氫呋喃-甲醇-0.05mol/L醋酸鈉(pH值6.2)(體積比為5∶75∶20);洗脫方式:線性梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.5.2 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品柱前衍生反應(yīng)

取樣品0.1mL，加入0.2mol/L pH值9.8的NaHCO30.9mL，再加入等量的Dns-Cl丙酮(2g/L)溶液，避光，置于30℃下衍生1 h。

1.5.3 轉(zhuǎn)化液中色素吸收波長的測定

量取一定量轉(zhuǎn)化液，以該溶液中色素濃度為100%，稀釋不同倍數(shù)，配成一定濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以去離子水為空白，測量其在450 nm波長下溶液的吸光度，平行3次。

1.5.4 轉(zhuǎn)化液脫色

選取溫度、時(shí)間、pH值和活性炭添加量4個(gè)因素，對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)行脫色實(shí)驗(yàn)，過濾，濾液在450 nm下測定吸光值，計(jì)算脫色率［12］:

式中:Ds為脫色率;A0為脫色前樣液的吸光度值;A為脫色后樣液的吸光度值

GABA保留率的計(jì)算公式:

式中:Dx為GABA保留率，%;C0為脫色前GABA質(zhì)量濃度，g/L;C為脫色后的GABA質(zhì)量濃度，g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)化液中GABA和L-Glu的測定

按照方法1.4.3進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備轉(zhuǎn)化液，對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)行衍生化，用HPLC進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 GABA、L-Glu以及轉(zhuǎn)化液HPLC檢測圖

用HPLC測得轉(zhuǎn)化液中GABA的含量為139.2 g，摩爾轉(zhuǎn)化率為99.3%;由圖1也可以看出，轉(zhuǎn)化液中L-Glu幾乎檢測不到，因此可以確定本實(shí)驗(yàn)中下一步分離純化過程不需要考慮L-Glu與GABA的分離，減少了繁瑣的離子交換［13］等分離步驟，節(jié)約了成本。

2.2 轉(zhuǎn)化液中色素吸收波長的測定

對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)行全波長掃描，掃描結(jié)果表明GABA轉(zhuǎn)化液無最大吸收波長，根據(jù)文獻(xiàn)［14］，GABA轉(zhuǎn)化液中的色素吸收峰應(yīng)在400～500 nm，按照1.5.3方法對(duì)轉(zhuǎn)化液中色素吸收波長的進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在450 nm下轉(zhuǎn)化液濃度與吸光度A的相關(guān)系數(shù)較高，相關(guān)性較好，所以選擇450 nm作為檢測波長。

圖2 色素濃度與吸光度(A)的關(guān)系

2.3 活性炭的選擇

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同顆粒大小的活性炭對(duì)預(yù)處理轉(zhuǎn)化液脫色效果差異很大，分別選擇不同顆粒大小的活性炭顆粒炭A，顆粒炭B，粉末炭C在相同的條件下對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)行脫色效果比較，結(jié)果見表2。

表2 不同顆粒大小的活性炭對(duì)脫色率的影響

由表2可知，粉末狀活性炭C的脫色效果十分顯著，經(jīng)處理后溶液清澈透明，脫色率達(dá)到91.2%。因此，選用粉末狀活性炭C作為脫色用炭。

2.4 活性炭脫色條件研究

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)確定脫色條件

按照工業(yè)上活性炭用量不超過3%的原則，選取溫度、時(shí)間、pH值和活性炭添加量4個(gè)因素，對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)行脫色實(shí)驗(yàn)，過濾，濾液在450 nm下測定吸光值，計(jì)算其脫色率、GABA保留率。

活性炭用量對(duì)轉(zhuǎn)化液的脫色效果影響較大(如圖3)，隨著活性炭用量的增加脫色效果越來越好，但當(dāng)活性炭用量超過2.0%時(shí)，脫色率增加的幅度比較小，而GABA的損失率卻繼續(xù)增加。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定選用2.0%作為最佳活性炭脫色濃度，該用量明顯低于工業(yè)應(yīng)用中活性炭用量不超過3%的要求。

圖3 活性炭用量對(duì)脫色效果的影響

轉(zhuǎn)化液的脫色效果隨著脫色時(shí)間的增加而越來越好(如圖4)，在超過30 min后，脫色率的變化幅度不大，而GABA的保留率隨著時(shí)間的延長卻越來越小，綜合考慮選擇脫色時(shí)間為30 min。

圖4 脫色時(shí)間對(duì)活性炭脫色效果的影響

溫度對(duì)活性炭脫色效果影響較大(如圖5)。由圖5可以看出，隨著脫色溫度的升高，脫色率升高，GABA保留率則降低，溫度從30℃升到60℃時(shí)，脫色率變化顯著，保留率降低的也較快，溫度升至60℃后，預(yù)處理液脫色率變化不明顯，而保留率也繼續(xù)降低，因此確定脫色溫度為60℃。

圖5 溫度對(duì)活性炭脫色效果的影響

轉(zhuǎn)化液的pH值對(duì)活性炭脫色效果有一定的影響(見圖6)，在pH值為5.0時(shí)，脫色率達(dá)到最大為93.3%，此時(shí)GABA的保留率也較高為89.3%，所以選擇脫色pH值為5.0。

圖6 pH值對(duì)活性炭脫色效果的影響

2.4.2 正交設(shè)計(jì)確定活性炭脫色最佳工藝條件

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇四因素三水平，按L9(43)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，見表3，以確定最佳的活性炭脫色工藝條件。

表3 活性炭脫色因素水平表

以預(yù)處理轉(zhuǎn)化液的脫色率、保留率為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定活性炭脫色的最佳工藝條件，具體的試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 活性炭脫色正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4分析得知，影響活性炭脫色效果的因素中，按影響程度的大小順序?yàn)锽＞D＞C＞A。最佳的工藝條件為A2B3C3D2;而在脫色過程中對(duì)GABA的保留率的影響因素順序?yàn)锳＞D＞C＞B，依次為pH值、時(shí)間、活性炭添加量和溫度，最佳工藝條件為A1B3C1D2。綜合考慮脫色率和GABA的保留率，最終確定工藝條件為A1B3C1D2，即在70℃下、調(diào)節(jié)pH值為4.0、添加1.5%的活性炭、脫色40 min。在最佳工藝條件下進(jìn)行了脫色的效果試驗(yàn)，脫色率為98.42%，GABA的保留率為97.23%。

2.5 轉(zhuǎn)化液中GABA分離純化及產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)

按照方法1.4.3進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)化液，用HPLC測其中GABA的含量為139.2 g，按上述脫色條件進(jìn)行進(jìn)行脫色后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至稀糊狀，加入3倍體積的95%乙醇靜置12 h，過濾干燥后得到128.7gGABA成品，用氨基酸自動(dòng)分析儀分析(圖7)，產(chǎn)品純度可達(dá)96.7%，整個(gè)工藝GABA的回收率為89.4%。

圖7 GABA成品氨基酸自動(dòng)分析儀分析圖譜

3 結(jié)論

目前，以生物合成法生產(chǎn)GABA，由于下游分離提取困難，已成為微生物法工業(yè)化生產(chǎn)GABA的主要制約因素，因此GABA的分離提取工藝已成為研究熱點(diǎn)。王文等［3］采用高速離心、超濾和稀釋過濾相結(jié)合的方法，將GABA的回收率由原來的50%提高到將近95%，但 GABA的純度仍然較低，僅為31.63%。王兢［4］采用NKA-9大孔吸附樹脂和陰離子交換樹脂D201對(duì)乳酸菌SK005發(fā)酵生產(chǎn)GABA的發(fā)酵液進(jìn)行脫色純化處理，產(chǎn)品的純度達(dá)到了90.8%，但收率不高。本研究小組前期利用高轉(zhuǎn)化率的植物乳桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)GABA，避免了發(fā)酵液成分復(fù)雜給下游提取造成的不利影響，但同時(shí)也存在轉(zhuǎn)化液顏色較深等問題，因此本研究對(duì)轉(zhuǎn)化液脫色工藝條件進(jìn)行了研究。確定了活性炭脫色的最佳工藝條件:活性炭用量1.5%，脫色溫度70℃，pH值4.0，脫色時(shí)間40 min，GABA轉(zhuǎn)化液的脫色率高達(dá)98.42%，GABA的保留率可達(dá)97.23%。運(yùn)用此工藝對(duì)GABA轉(zhuǎn)化液進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，GABA的回收率為89.4%，純度為96.7%，回收率和純度在國內(nèi)均處于領(lǐng)先水平，而且該工藝操作簡單，成本低，具有工業(yè)化應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。

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Study on Separation and Purification Technology of γ-aminobutyric Acid by Whole-cell Bioconversion

Zhang Shu-cong，Liu Ting-ting，Yang Tao-wei，Xia Hai-feng，Rao Zhi-ming
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

A strain named Lactobacillus plantarum GB01-21 that can produce γ-aminobutyric(GABA)efficiently was screened in our laboratory.During the 20 hours，200g/L L-Glu can be transformed into 140g/L GABA.In this work，γ-aminobutyric was separated and purified from the whole-cell transforming solution.The decolorizing technical conditions such as temperature，time，pH and amount of active carbon were studied.As a result，the optimum decolorization conditions were determined through single factor and orthogonal experiments as follows:activated carbon dosage 1.5%，decolorization temperature 70 ℃，pH value 4.0 and decolorization time 30 min.Under these conditions，the decolorization rate and recovery rate of bioconversion broth reached 98.42%and 97.23%，respectively.Finally，γ-aminobutyric acid was isolated and purified from bioconversion broth and the recovery rate and the purity of γ-aminobutyric acid was 89.4%and 96.7%，respectively.These findings pave the way for industrial production of GABA.

γ-aminobutyric acid，whole-cell transforming，decolorization，separation and purification

碩士研究生(饒志明教授為通訊作者)

*國家“863計(jì)劃”(2007AA02Z207);國家自然科學(xué)基金(30970056);霍英東青年基金(121020)

2010－06－03，改回日期:2010－06－28