超高麥汁濃度釀造對(duì)啤酒酵母代謝的影響*

萬(wàn)春艷，趙海鋒，趙謀明

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)

超高麥汁濃度釀造對(duì)啤酒酵母代謝的影響*

萬(wàn)春艷，趙海鋒，趙謀明

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)

以11oP麥汁釀造作對(duì)比，研究了超高濃度釀造對(duì)酵母代謝的影響。結(jié)果表明，麥汁濃度升高降低了酵母利用葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖的效率，其中對(duì)麥芽三糖和麥芽糖的影響較葡萄糖顯著;隨著麥汁中糖的消耗，發(fā)酵液中乙醇濃度的增加使酵母活性降低，乙醇比生成速率降低，從而導(dǎo)致整個(gè)發(fā)酵速度減緩，發(fā)酵周期顯著延長(zhǎng);酵母通過(guò)在胞內(nèi)大量積累海藻糖和甘油來(lái)應(yīng)對(duì)高濃度麥汁所造成的高滲透壓和高乙醇環(huán)境，麥汁濃度越高積累量越大。

超高濃度釀造，高濃度釀造，酵母代謝

高濃度釀造是采用較高濃度的麥汁(＞14oP)進(jìn)行發(fā)酵，在生產(chǎn)過(guò)程的后期用飽和的CO2脫氧水稀釋成正常濃度的啤酒的一種生產(chǎn)技術(shù)。利用18°P以上麥汁釀造稱為超高濃釀造(Very High Gravity Brewing，VHGB)。與普通濃度釀造相比，VHGB可在不增加糖化和發(fā)酵設(shè)備的基礎(chǔ)上大幅度提高啤酒產(chǎn)量，提高啤酒生產(chǎn)效率，具有明顯的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)［1］。超高濃度麥汁中含有高濃度的可發(fā)酵性糖(麥芽糖、麥芽三糖和葡萄糖)，導(dǎo)致發(fā)酵初期發(fā)酵液的滲透壓較高，發(fā)酵后期乙醇濃度較高及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量低等問(wèn)題［2－3］。這些環(huán)境壓力使得酵母生長(zhǎng)代謝受到抑制，進(jìn)而滯緩或停止發(fā)酵。

目前，VHGB對(duì)酵母發(fā)酵性能影響的研究，國(guó)外集中于分析酵母某些與發(fā)酵相關(guān)的基因的表達(dá)水平上。如Mizuno［4］等通過(guò)研究1株高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)乙酸的突變菌株，發(fā)現(xiàn)其與糖酵解有關(guān)的許多基因的轉(zhuǎn)錄水平大大提高;Blieck［5］等證實(shí)了酵母發(fā)酵性能的提高與某些基因的改變有關(guān)。但這些分析并不系統(tǒng)而且彼此之間缺乏聯(lián)系。國(guó)內(nèi)則主要針對(duì)高滲透壓、高乙醇含量等某一方面對(duì)酵母性能的影響進(jìn)行闡述。如董永勝［6］等以氣體為加壓介質(zhì)，研究了不同壓力下酵母細(xì)胞生長(zhǎng)特性及壓力對(duì)酵母發(fā)酵性能的影響。但在VHGB中，針對(duì)酵母細(xì)胞的代謝情況還缺乏系統(tǒng)的分析，而這些正是從根本上改善和提高酵母發(fā)酵性能的基礎(chǔ)。因此，本文系統(tǒng)研究了在VHGB中，啤酒酵母對(duì)可發(fā)酵性糖的利用、產(chǎn)乙醇情況以及胞內(nèi)物質(zhì)甘油和海藻糖含量的變化情況，以期從代謝和酵母的響應(yīng)角度深入了解高濃釀造對(duì)酵母生理活性的影響，為啤酒高濃釀造優(yōu)良菌種的選育提供理論基礎(chǔ)。基于這些理論指導(dǎo)，耐超高濃釀造的酵母菌株正在選育當(dāng)中。

1 材料與方法

1.1 菌種

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FB95，華南理工大學(xué)食品生物技術(shù)研究室保藏。

1.2 麥汁制備和發(fā)酵條件

麥汁制備:1 kg麥芽粉碎，以1∶4(g∶mL)的料水比進(jìn)行糖化，45℃恒溫30 min，升溫至63℃恒溫1 h，70℃恒溫10 min，碘試，78℃恒溫10 min后過(guò)濾，洗糟，105℃煮沸1.5 h。麥汁定型18oP，然后用60oP麥葡糖漿將麥汁濃度調(diào)至24oP(超高濃度麥汁)，將超高濃度麥汁分別稀釋成18oP麥汁(高濃度麥汁)和12oP麥汁(正常濃度麥汁)，121℃滅菌15 min。

發(fā)酵條件:種子擴(kuò)培見(jiàn)參考文獻(xiàn)［7］;VHGB接種量為8 g(酵母泥)/L、高濃釀造接種量為6 g(酵母泥)/L、正常濃度釀造接種量為4 g(酵母泥)/L，12℃厭氧發(fā)酵。

1.3 主要設(shè)備和試劑

全自動(dòng)糖化儀，杭州博日科技有限公司;低溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;7LEBC發(fā)酵管，北京德之杰啤酒科技有限公司;Waters 600高效液相色譜儀。

葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖為色譜純(Sigma公司);其他藥品為分析純;高濃麥葡糖漿(廣州珠江啤酒有限公司)。

1.4 分析方法

麥汁表觀濃度、表觀發(fā)酵度、菌體干重(DCW)、菌體活性的分析見(jiàn)參考文獻(xiàn)［8］;麥汁中糖分析:高效液相色譜法(HPLC)，色譜柱(Waters Spherisorb 5 μm NH24.6 ×250mm)，方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［9］; 胞內(nèi)海藻糖和甘油的提取與分析見(jiàn)參考文獻(xiàn)［10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 麥汁濃度對(duì)酵母糖利用的影響

啤酒酵母FB95是1株用于正常濃度釀造(Normal Gravity Brewing，NGB)的啤酒酵母，在低于12oP麥汁中可正常發(fā)酵，當(dāng)表觀發(fā)酵度達(dá)到80%時(shí)，主發(fā)酵周期為7d(見(jiàn)圖1)。隨著麥汁濃度的升高，啤酒酵母FB95主發(fā)酵周期明顯延長(zhǎng)，高濃釀造(High Gravity Brewing，HGB)時(shí)為15d，VHGB 的時(shí)為28 d。

圖1 不同濃度麥汁的降糖曲線

這是由于麥汁濃度越高，麥汁、發(fā)酵液的滲透壓和乙醇產(chǎn)量也相應(yīng)升高，滲透壓升高使酵母形成生理干燥，乙醇濃度過(guò)高也對(duì)酵母產(chǎn)生毒害作用［11］，因此酵母生理活性降低，降糖速率也隨之降低，主發(fā)酵周期延長(zhǎng)。

麥汁成分復(fù)雜，其中主要的可發(fā)酵性糖包括葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖［12］，酵母對(duì)這3種糖利用的快慢直接影響其發(fā)酵速率。為研究VHGB和HGB中發(fā)酵周期延長(zhǎng)的深層原因，本文檢測(cè)了麥汁和發(fā)酵液中3種糖的含量，并對(duì)酵母降糖曲線進(jìn)行擬合計(jì)算得到了酵母對(duì)3種糖的比吸收速率。由表1可知，在HGB和VHGB中，酵母對(duì)3種糖的最大比吸收速率和平均比吸收速率與NGB相比均有下降，VHGB下降的最大，HGB次之。在HGB中，比較最大和平均比吸收速率相對(duì)NGB的下降率發(fā)現(xiàn)，麥芽三糖的下降率最大(37.90%和 47.43%)，麥芽糖次之(20.34%和 44.36%)，葡萄糖最小(18.16%和46.76%)。在VHGB中，麥汁濃度進(jìn)一步升高，對(duì)酵母代謝影響更加顯著，麥汁三糖的最大和平均比吸收速率下降率分別為67.75%和68.15%，麥芽糖的分別為36.51%和62.83%，葡萄糖的分別為29.54%和57.52%。上述結(jié)果表明葡萄糖與麥芽糖和麥芽三糖不同的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，酵母對(duì)麥芽糖和麥芽三糖的吸收需要能量(ATP轉(zhuǎn)化成ADP)，而葡萄糖的吸收則不需要能量［12］。因此在高濃麥汁中，酵母活性降低，對(duì)麥芽糖和麥芽三糖的利用效率顯著降低，是造成發(fā)酵后期降糖速率降低的重要原因。

表1 不同麥汁濃度對(duì)酵母利用麥汁糖的影響

2.2 麥汁濃度對(duì)酵母產(chǎn)乙醇的影響

由圖2(A)知，麥汁濃度越高，發(fā)酵結(jié)束時(shí)乙醇濃度也越高，VHGB、HGB和NGB的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為11.1%、7.99%和5.14%。高濃度的乙醇使酵母細(xì)胞膜的透性和構(gòu)造發(fā)生變化，引起細(xì)胞膜對(duì)H+的通透性增加，使H+大量進(jìn)入細(xì)胞，降低了細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度梯度，并使細(xì)胞質(zhì)的pH值下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生變化，活性降低。酵母活性降低導(dǎo)致乙醇生成能力降低，結(jié)果見(jiàn)圖2(B)，在NGB、HGB和VHGB中，乙醇的比生成速率變化趨勢(shì)相同，在發(fā)酵初期比生成速率迅速下降，并隨發(fā)酵的進(jìn)行進(jìn)一步降低，到發(fā)酵后期基本保持不變。

2.3 酵母對(duì)高濃度麥汁的響應(yīng)

啤酒釀造過(guò)程是個(gè)復(fù)雜的生化反應(yīng)過(guò)程，在此過(guò)程中，酵母的發(fā)酵環(huán)境不斷變化。酵母細(xì)胞通過(guò)調(diào)控胞內(nèi)的代謝情況能快速適應(yīng)這些環(huán)境的變化。酵母胞內(nèi)的海藻糖和甘油被認(rèn)為是酵母細(xì)胞應(yīng)對(duì)環(huán)境變化(乙醇濃度和滲透壓升高)最重要的2種物質(zhì)［13］。

圖2 不同濃度麥汁發(fā)酵過(guò)程中酵母的乙醇濃度(A)和比生成速率(B)變化

海藻糖不僅是酵母胞內(nèi)一種重要的貯藏性碳源，并且具有穩(wěn)定細(xì)胞膜，使細(xì)胞具有更強(qiáng)的抵御外界不良環(huán)境維持正常生理功能的作用［14－16］。由圖3可知，發(fā)酵初始，酵母胞內(nèi)海藻糖迅速積累，且麥汁濃度越高，積累量越大，在NGB、HGB和VHGB中，酵母胞內(nèi)海藻糖的最高含量分別為6.81%、9.59%和10.88%。這是酵母對(duì)高乙醇濃度所作出的響應(yīng)。隨著糖類物質(zhì)的消耗，海藻糖的含量又迅速下降，原因一方面可能是海藻糖作為碳源物質(zhì)被消耗，另一方面則可能是過(guò)高的滲透壓和乙醇的毒性導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性改變，影響了海藻糖的合成與積累。

圖3 不同濃度麥汁發(fā)酵過(guò)程中酵母胞內(nèi)海藻糖含量變化

由圖4可知，麥汁濃度越高，所產(chǎn)的胞內(nèi)甘油也越多，在NGB、HGB和VHGB中酵母胞內(nèi)的甘油最高含量分別為8.85%、11.00%和13.08%。隨著發(fā)酵的進(jìn)行胞內(nèi)甘油迅速被消耗。甘油是酵母胞內(nèi)最主要的相容性物質(zhì)，能在胞內(nèi)以高濃度存在而不對(duì)胞內(nèi)的酶產(chǎn)生抑制或失活作用，當(dāng)細(xì)胞處于高滲透壓環(huán)境中時(shí)，細(xì)胞便通過(guò)提高胞內(nèi)甘油的積累來(lái)抵御胞內(nèi)水分外流，維持胞內(nèi)外滲透壓的平衡［14－16］。

圖4 不同濃度麥汁發(fā)酵過(guò)程中酵母胞內(nèi)甘油含量變化

綜合胞內(nèi)海藻糖和甘油的情況，發(fā)現(xiàn)在HGB中，酵母最直接的自我保護(hù)機(jī)制是通過(guò)海藻糖和甘油在胞內(nèi)的大量積累來(lái)應(yīng)對(duì)高濃麥汁所造成的高滲透壓環(huán)境，積累量與麥汁濃度成正相關(guān)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，二者濃度迅速降低的原因又有所不同，海藻糖可能作為一種儲(chǔ)藏性碳源被消耗，甘油則可能被運(yùn)輸?shù)桨?，從而使得胞?nèi)的濃度逐漸降低。

3 結(jié)論

(1)麥汁濃度升高使主發(fā)酵周期延長(zhǎng)，NGB、HGB和VHGB的主發(fā)酵周期分別為7、15和28 d。

(2)麥汁濃度升高影響了酵母利用葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖的效率，對(duì)麥芽三糖和麥芽糖利用效率的影響比葡萄糖大，是主發(fā)酵后期降糖速率降低的重要原因。

(3)麥汁濃度升高，發(fā)酵液中乙醇濃度增加，使酵母活性降低，乙醇比生成速率降低。

(4)在HGB和VHGB中，酵母胞內(nèi)的海藻糖和甘油含量比NGB高，反映了酵母對(duì)高濃度麥汁的自身調(diào)控作用。

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Effects of Very High Gravity Brewing on the Metabolism of Saccharomyces cerevisiae

Wan Chun-yan，Zhao Hai-feng，Zhao Mou-ming
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

Effects of super high gravity brewing on the metabolism of Saccharomyces cerevisiae were examined in the present study.The results showed that higher gravity of wort caused significant decreased in utilization efficiency of Saccharomyces cerevisiae for glucose，maltose and maltotriose，particularly for maltose and maltotriose.Ethanol concentration in fermentation broth increased with the consumption of sugar which then decreased the yeast activity and the production rates of ethanol，and consequently slowed down the fermentation process and prolonged the fermentation time.Yeast responded to high osmotic pressure and high－alcohol environment caused by high gravity wort by accumulating trehalose and glycerol in the intracellular.The accumulation of trehalose and glycerol in the intracellular depends on the gravity of wort.

very high gravity brewing，high gravity brewing，metabolism of yeast

碩士研究生(趙海鋒博士為通訊作者)。

*國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAI63B06)廣東省科技計(jì)劃工業(yè)項(xiàng)目(2009A010700004，2010A010500002)

2010－05－17，改回日期:2010－09－28