無錫他汀分離式分段發(fā)酵初步研究

牟琳，諸葛斌，方慧英，諸葛健

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室和工業(yè)微生物研究中心，江蘇無錫，214122)

無錫他汀分離式分段發(fā)酵初步研究

牟琳，諸葛斌，方慧英，諸葛健

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室和工業(yè)微生物研究中心，江蘇無錫，214122)

無錫他汀是一種新型HMG-CoA還原酶抑制劑，由洛伐他汀經(jīng)擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST2710)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的產(chǎn)物之一。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物Ⅰ則作為洛伐他汀轉(zhuǎn)化為無錫他汀的中間產(chǎn)物，是影響無錫他汀生成及其產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中2種產(chǎn)物形成時的pH值有所不同。為提高無錫他汀產(chǎn)率，研究以pH值為主要調(diào)節(jié)因素，對發(fā)酵過程pH值調(diào)節(jié)、菌體補加和pH值協(xié)同調(diào)節(jié)，以及分離式分段發(fā)酵工藝進行了較全面的考察。結(jié)果表明，分離式分段發(fā)酵模式最好，即將產(chǎn)物Ⅰ分離提純后作為底物再次發(fā)酵生成無錫他汀，2個階段的pH值分別為7.5和5.5。同時也考察了金屬離子對發(fā)酵的影響，研究表明，F(xiàn)e2+、Mg2+和Cu2+對2種產(chǎn)物的生成均有一定促進作用。經(jīng)策略優(yōu)化，無錫他汀轉(zhuǎn)化率提高15%，縮短了發(fā)酵時間，并使最終產(chǎn)物更易純化。這種利用同菌株分離式分段發(fā)酵模式廣泛為生成過程中存在中間產(chǎn)物或發(fā)酵時間較長的發(fā)酵過程的研究提供參考。

無錫他汀，同一菌株分離式分段發(fā)酵，pH值控制策略

他汀類藥物屬于羥甲基戊二酰輔酶A(HMGCoA)還原酶抑制劑，為降脂藥物中的首選藥物，也是國內(nèi)外研究的熱點［1］。無錫他汀是由洛伐他汀經(jīng)擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.)ST 2710 轉(zhuǎn)化產(chǎn)生［2］。通過體外檢測洛伐他汀及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對HMG-CoA還原酶活性的抑制作用，發(fā)現(xiàn)洛伐他汀對酶的IC50(他汀類物質(zhì)抑制HMG-CoA還原酶活力50%時所用他汀類物質(zhì)的量)為805.72μg/mL，而無錫他汀的IC50為202.17μg/mL，抑制作用為洛伐他汀的4倍，是一種新型高效羥甲基戊二酰酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑［3］，具有廣闊的應(yīng)用價值。

前期研究表明，洛伐他汀通過生物轉(zhuǎn)化而來的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物Ⅰ和無錫他汀在發(fā)酵產(chǎn)量上存在著偶聯(lián)關(guān)系，并初步確定該生物轉(zhuǎn)化過程分為2個階段［4］。此類產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化若采用常規(guī)發(fā)酵工藝對于產(chǎn)物的生成與產(chǎn)率可能產(chǎn)生負面影響，其主要原因可能是轉(zhuǎn)化途徑上相關(guān)酶的酶促最適條件存在差異，如pH、離子及反應(yīng)體系成分等，而且，在某種環(huán)境下，以不同底物進行代謝和轉(zhuǎn)化時，細胞需要做生理上的調(diào)整，這不僅會影響轉(zhuǎn)化效率，而且由于細胞的調(diào)整導(dǎo)致發(fā)酵過程時間延長。本研究根據(jù)無錫他汀的轉(zhuǎn)化特點，通過對發(fā)酵過程pH調(diào)節(jié)、菌體補加和pH協(xié)同調(diào)節(jié)，以及分離式分段發(fā)酵工藝進行了較全面的考察，嘗試了一種同菌株的分離式分段發(fā)酵工藝，獲得了良好的轉(zhuǎn)化效果，這不僅為提高無錫他汀的生產(chǎn)與進一步研究打下了基礎(chǔ)，而且該工藝可以為某些轉(zhuǎn)化過程中存在中間產(chǎn)物累積且轉(zhuǎn)化效率低、發(fā)酵時間較長的發(fā)酵產(chǎn)品提供一種解決途徑。

1 材料與方法

1.1 菌株

擬無枝酸菌ST2710(Amycolatopsis sp.ST2710)，從自然界分離，本中心保藏。

1.2 培養(yǎng)基

A.高氏合成1號液體培養(yǎng)基(g/L):KNO31，無水K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，可溶性淀粉20，去離子水 1 000mL，pH 7.2～7.4

B.轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉50，Hycase SF 2，玉米漿5，去離子水1 000mL

1.3 產(chǎn)物Ⅰ的制備

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基加底物后20h，產(chǎn)物Ⅰ大量生成而無錫他汀還未形成時離心濃縮，以大孔吸附樹脂為柱填料，甲醇為洗脫劑進行階段式洗脫，并收集富集產(chǎn)物Ⅰ的洗脫液，濃縮后微孔膜過濾除菌備用。

1.4 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng):將斜面Amycolatopsis sp.ST 2710接種到種子培養(yǎng)基(250mL三角瓶裝50mL)中，28℃靜止培養(yǎng)48 h。

孢子懸浮液的制備:種子液通過2層擦鏡紙過濾，將菌絲體過濾除掉，收集的濾液為孢子種子液。

搖瓶發(fā)酵條件:10%接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，回轉(zhuǎn)式搖床150 r/min，30℃培養(yǎng)48 h后，加入洛伐他汀溶液，繼續(xù)轉(zhuǎn)化48h至發(fā)酵結(jié)束。

1.5 高效液相色譜紫外檢測分析(LC-UV)

色譜柱為 Kromasil C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm);流動相為甲醇-0.5%乙酸(80∶20);流速為1mL/min;柱溫25℃;進樣量20μL;檢測波長237 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 無錫他汀轉(zhuǎn)化過程中pH產(chǎn)生的影響

pH是無錫他汀生物轉(zhuǎn)化的主要影響因素之一，利用HPLC對轉(zhuǎn)化過程的產(chǎn)物和pH進行測定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物Ⅰ形成期最適pH呈弱堿，無錫他汀出現(xiàn)和累積處于pH為酸性階段，pH大約在20h以后開始下降。2產(chǎn)物生成過程及pH變化如圖1所示。

圖1 兩產(chǎn)物生成過程HPLC分析圖

2.2 發(fā)酵過程中的pH值兩段控制

由于發(fā)酵過程中2種產(chǎn)物產(chǎn)生時的pH有所不同，研究根據(jù)報道嘗試采用pH值兩階段控制策略［5］。

在產(chǎn)物生成的發(fā)酵過程中，在無錫他汀形成初期將發(fā)酵液 pH 值調(diào)節(jié)為 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，發(fā)酵結(jié)束后取樣檢測。

結(jié)果表明(圖2)，pH值調(diào)至偏酸性時，無錫他汀的轉(zhuǎn)化率與偏堿性時相比有提高，這與無錫他汀需在偏酸性條件下形成的推論相同，而且當(dāng)pH值調(diào)節(jié)為5.5時，轉(zhuǎn)化率比自然發(fā)酵提高了3%。由此可見在發(fā)酵轉(zhuǎn)化過程中調(diào)節(jié)pH對于無錫他汀的轉(zhuǎn)化有利。

圖2 pH值對無錫他汀轉(zhuǎn)化率的影響

2.2 菌液補加與pH值協(xié)同調(diào)節(jié)

為進一步提高產(chǎn)物I向無錫他汀的轉(zhuǎn)化，縮短由于菌體在pH值變化時的生理調(diào)整期，在發(fā)酵中調(diào)節(jié)pH值的同時補充新鮮的菌液，結(jié)果如圖3所示。

圖3 加入新鮮菌液并調(diào)節(jié)pH值對無錫他汀轉(zhuǎn)化率的影響

結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化率最高出現(xiàn)在pH值5.5，轉(zhuǎn)化率比對照提高4%。原因可能是新加入的菌體沒有經(jīng)過產(chǎn)物Ⅰ形成期弱堿性環(huán)境中的培養(yǎng)期，無法直接發(fā)揮轉(zhuǎn)化作用，或以上因素對于發(fā)酵轉(zhuǎn)化率有一定影響，但并非主要影響因素。

2.3 分離式分段調(diào)節(jié)pH值

為了進一步提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，采取了分離式分段發(fā)酵模式:將孢子懸浮液按10%的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基一號中，回轉(zhuǎn)式搖床30℃培養(yǎng)48 h后，加入洛伐他汀溶液，轉(zhuǎn)化20 h后將發(fā)酵液在4℃下8 000 r/min離心，取上清液。利用大孔吸附樹脂分離提純產(chǎn)物Ⅰ，收集富集產(chǎn)物的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并微孔過濾除菌備用。將提純的產(chǎn)物Ⅰ作為底物再次轉(zhuǎn)化15 h，生成無錫他汀。

檢測結(jié)果表明，無錫他汀的生成率有明顯提高。進一步研究pH值對2種產(chǎn)物的形成影響:在底物轉(zhuǎn)化第1階段和第2階段，即產(chǎn)物Ⅰ生成期和無錫他汀生成期，將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)成4.5、5.5、6.5、7.5、8.5。

由圖4可見，2個階段的最適pH值有較大差異。產(chǎn)物Ⅰ的形成階段最適pH值為7.5，原因可能是大多。單加氧酶的最適pH值均在中性或偏堿性［6－7］;而無錫他汀形成期pH值為5.5時，與原發(fā)酵方法相比，轉(zhuǎn)化率也提高了13%，同時由產(chǎn)物Ⅰ轉(zhuǎn)化為無錫他汀的時間明顯縮短。因此，分離式分段發(fā)酵模式具有較明顯的優(yōu)勢。

圖4 pH值對兩步轉(zhuǎn)化過程的影響

2.4 金屬離子對兩步轉(zhuǎn)化過程的影響

金屬離子是微生物生長過程中所需要的微量元素，對菌體的生長及部分酶的活性都有一定的影響［8－9］。實驗考察了在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加部分金屬離子對兩步轉(zhuǎn)化過程的影響情況。

圖5 金屬離子對兩步轉(zhuǎn)化的影響

由圖可見，F(xiàn)e2+、Mg2+和Cu2+對于兩步轉(zhuǎn)化均有一定的促進作用。其中Fe2+是許多單加氧酶所含血紅素的組成部分，添加該離子有利于氧的結(jié)合和電子傳遞，從而提高產(chǎn)率［10］;Mg2+和 Cu2+則有利于酶的穩(wěn)定。3種對發(fā)酵有促進作用的金屬離子對于2種產(chǎn)物的最適添加量有所不同，2個階段分別通過3因素3水平正交試驗進一步確定2種產(chǎn)物生成時上述3種金屬離子添加量(表1)。

表1 正交試驗結(jié)果

最終結(jié)合pH值調(diào)節(jié)及金屬離子的添加，在分離式分段發(fā)酵模式下，無錫他汀的轉(zhuǎn)化率提高了15%。

3 討論

本研究通過改進獲得了分離式分段發(fā)酵轉(zhuǎn)化無錫他汀的方法，即第一階段在pH為7.5、c［Fe2+］濃度0.857 mmol/L、c［Mg2+］0.257 mmol/L和c［Cu2+］0.040 mmol/L的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物Ⅰ，產(chǎn)物Ⅰ經(jīng)分離提純由已培養(yǎng)好菌體在 pH 為 5.5，c［Fe2+］1.429 mmol/L、c［Mg2+］0.429 mmol/L和c［Cu2+］0.040 mmol/L 的發(fā)酵條件下生成無錫他汀。此發(fā)酵模式使得無錫他汀的轉(zhuǎn)化率較原有傳統(tǒng)發(fā)酵模式提高了15%。

pH值作為影響發(fā)酵水平的重要理化因素，在不同微生物甚至同一微生物的不同生長階段對生物生長代謝起重要作用，pH值的調(diào)節(jié)是優(yōu)化發(fā)酵的主要手段。對于存在中間產(chǎn)物的發(fā)酵過程，為了提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量而通常采用改變發(fā)酵條件，研究主要集中在發(fā)酵過程中不同階段的條件調(diào)節(jié)［5］，即分段控制發(fā)酵。對于需要利用不同菌通過二步或三步順序發(fā)酵生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品的工藝稱為分步發(fā)酵，例如兩步法發(fā)酵生成1，3-丙二醇［11］。本文以同一菌株兩步不同pH值和離子濃度進行分離發(fā)酵生產(chǎn)無錫他汀取得了良好的效果，這種發(fā)酵模式可以為生成過程中存在中間產(chǎn)物積累且轉(zhuǎn)化條件存在差異的的發(fā)酵過程的優(yōu)化提供借鑒。

［1］董亞琳，董衛(wèi)華.他汀類藥物的研究進展［J］.中國新藥雜志，2003，12(3):175－178.

［2］諸葛鍵，方慧英，于海.一種擬無枝酸菌及其生物轉(zhuǎn)化洛伐他汀為無錫他汀的技術(shù)［P］.CN，200410044893.6.

［3］于海.Amycolatopsis sp.的篩選及其轉(zhuǎn)化洛伐他汀的研究［D］.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，2004

［4］付維來，諸葛斌，于海，等.擬無枝酸菌ST2710轉(zhuǎn)化洛伐他汀為無錫他汀過程的初步研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(10):23－27.

［5］張芙華，陳晟，張東旭，等.pH兩階段控制策略發(fā)酵生產(chǎn)重組角質(zhì)酶［J］.中國生物工程雜志，2008，28(5):59－64.

［6］華紹烽，李樹本，辛嘉英，等.一個Ⅱ型甲烷氧化菌中甲烷單加氧酶羥基化酶的分離純化和理化性質(zhì)［J］.生物工程學(xué)報，2006，22(6):1 007－1 012.

［7］Meneely K M，Lamb A L.Biochemical characterization of an FAD-dependent monooxygenase，the ornithine hydroxylase from Pseudomonas aeruginosa，suggests a novel reaction mechanism［J］.Biochemistry，2007，46(42):11 930－11 937.

［8］湯海云，郭元昕，李嘯，等.金屬離子對林可霉素生物合成的影響［J］.中國抗生素雜志，2007，32(12):723－726.

［9］Watschinger K，Keller M A，et al.Glyceryl ether monooxygenase resembles aromatic amino acid hydroxylases in metal ion and tetrahydrobiopterin dependence［J］.Biol Chem，2009，390(1):3－10.

［10］冷欣夫，邱星輝.細胞色素P450酶系的結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用前景［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:13－21.

［11］劉海軍，徐友海，張代佳，等.兩步法發(fā)酵生成1，3-丙二醇的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(6):4－7.

Studies on Separative Subsection Fermention of Wuxistatin

Mou Lin，Zhuge Bin，F(xiàn)ang Hui-ying，Zhuge Jian
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education Research Center of Industrial Microorganisms，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Wuxistatin was a novel inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutary(HMG)-CoA reductase which was the rate-limiting enzyme in the process of cholesterol synthesis.Amycolatopsis sp.ST2710 could convert lovastatin into wuxistatin.ProductⅠ，as the intermediate，was the key factor of producing wuxistatin.It was found that two products had different optimum pH.To increase the yield，the study took pH as the main factor to investigate by three ways:adjusting pH during fermentation;adjusting pH cooperated with adding fresh bacteria solution;separative subsection fermentation.Finally we found that the separative subsection fermentation had the best result.So the method was introduced:firstly，productⅠwas formed from lovastatin，pH 7.5 and pured by macroporous resin;then the conditions of fermentation were changed to pH 5.5 for transferring pured productⅠto wuxistatin.At the same time，the effect of some metal ions on transformation was studied and the result showed that Fe2+，Mg2+and Cu2+could improve fermentation level.By this way，the convertion would increase by 15%，the time was shorten by a big margin and the final product would be more easily to purify.The fermentation pattern that based on one strain could provide reference for the study of fermentation with intermediate product and long-time fermentation.

Wuxistatin separative，subsection fermentation with one strain，pH control strategy

碩士研究生(諸葛斌教授為通訊作者)。

2010－09－05