非水相中固定化酶水解制備玉米肽的體外醒酒活性研究*

吳暉，李麗麗，李曉鳳，余以剛

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)

非水相中固定化酶水解制備玉米肽的體外醒酒活性研究*

吳暉，李麗麗，李曉鳳，余以剛

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)

對在非水相中經(jīng)固定化堿性蛋白酶Alcalase 2.4L水解的玉米蛋白肽的體外醒酒活性進(jìn)行了研究。考察了在體外試驗中，玉米肽對乙醇脫氫酶(ADH)及對乙醛脫氫酶(ALDH)活力的影響，分析了活性最高的酶解物的氨基酸組成和相對分子量分布及其與醒酒活性之間的關(guān)系。結(jié)果表明:當(dāng)控制水解度最高為22.7%時，非水相中制備的玉米肽在體外試驗中對乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(ALDH)的激活作用最高，ADH激活率可達(dá)27.1%，ALDH激活率可達(dá)50.0%，此高醒酒活性肽中含有較高比例的Ala、Leu及Pro，尤其是Leu，3種氨基酸含量均高于相同水解度下水相中制備的玉米肽的氨基酸含量。在酶解產(chǎn)物分子量＜3 548 u，其中分子量＜1 295 u的肽含量最多，約占80%，以2～10肽為主。

非水相，固定化，玉米肽，醒酒活性

玉米蛋白粉是玉米濕法加工中的主要副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量達(dá)60%以上，但由于玉米蛋白溶解性差［1］，缺乏賴氨酸等必需氨基酸，嚴(yán)重限制了其在食品中的應(yīng)用。玉米蛋白粉經(jīng)酶水解得到的活性肽具有促進(jìn)乙醇代謝及消除疲勞［2］、抗氧化［3］、降低血氨濃度及降血壓［4］的作用。Yamaguchi等率先利用堿性蛋白酶水解玉米蛋白，制得了具有生理活性的玉米肽，并發(fā)現(xiàn)玉米肽具有促進(jìn)酒精代謝作用［4－6］。經(jīng)常過量飲酒，會損害肝、胃、脾等內(nèi)臟器官，造成胃潰瘍、肝硬化等疾?。?］。近年來，隨著國民經(jīng)濟(jì)水平的提高和保健意識的增強(qiáng)，大眾越來越重視解酒保健問題。因此，利用純天然玉米黃粉制備高醒酒活性玉米肽，具有較高的實踐價值和應(yīng)用意義。

應(yīng)用游離蛋白酶在水相中對玉米蛋白進(jìn)行水解制備玉米肽已經(jīng)有不少報道［7］。但在非水相中進(jìn)行酶解反應(yīng)且深入研究其與體外醒酒活性的關(guān)系的報道較少。基于上述研究現(xiàn)狀，本文首次系統(tǒng)探討了非水相中蛋白酶催化玉米蛋白粉所得各水解物的不同水解度與其體外醒酒活性的關(guān)系，并確立了非水體系中可控酶解制備高醒酒活性玉米肽的酶催化體系，旨在為醒酒肽產(chǎn)品的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

玉米蛋白粉(蛋白含量為57.31%)，吉林吉發(fā)集團(tuán)提供，過80目篩備用;Alcalase 2，4L FG，酶活力2.4AU/g，購自丹麥Novo公司;氧化型輔酶I(NAD)、吡唑、乙醇脫氫酶ADH(451 U/mg)，購自羅氏公司;乙醛脫氫酶ALDH，購自美國Sigma公司;海藻酸鈉、無水 CaCl2、NaOH、NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、HCl、焦磷酸鈉、明膠、乙醇(95%)、乙醛、四氫呋喃、異丙醇，均為市售分析純試劑。

高速離心機(jī)，科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司;電子分析天平，上海精密科學(xué)有限公司;pH-star裝置，自制;電動攪拌機(jī)，江蘇省金壇市進(jìn)程教學(xué)儀器廠;UV－102－02WF紫外可見分光光度計，日本Shimadzu公司;高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化Alcalase蛋白酶的制備［8］

以海藻酸鈉為載體，將Alcalase蛋白酶固定化。

1.2.2 玉米濃縮蛋白粉酶解物的制備［9］

(1)原料脫脂。稱取一定量的玉米蛋白粉，按固液比為1∶10加入8%的NaHCO3溶液，放入恒溫水浴振蕩鍋中，40℃，振蕩20 min。5 000 r/min離心10 min，并反復(fù)水洗，至pH值接近7，收集沉淀得脫脂玉米蛋白粉。

(2)濃縮玉米蛋白的制備。取一定量的脫脂玉米蛋白粉，按固液比1∶10。加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，50～60℃水浴30 min后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的NaOH調(diào)節(jié)pH值至9.0。加蒸餾水使乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，萃取30 min，在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%CaCl 1∶1鹽析，靜置12 h后，離心得濕玉米醇溶蛋白，反復(fù)水洗保證pH值在7.0左右，真空冷凍干燥，即得玉米濃縮蛋白粉。

1.2.3 玉米肽酶解反應(yīng)及產(chǎn)物制備［10］

稱取玉米濃縮蛋白粉于具塞三角瓶中，加入醇水(1∶1，v/v)溶液，配成底物濃度為 5%(w/v)，然后置于55℃恒溫水浴振蕩鍋中，振蕩10 min以使其充分溶解，加入固定化酶，用量為8%(w/v)，在pH8.5，溫度55℃下，控制轉(zhuǎn)速在200 r/min水解一段時間。根據(jù)pH-stat法，在反應(yīng)過程中加入1mol/L的標(biāo)準(zhǔn)NaOH維持反應(yīng)液的pH不變，通過調(diào)節(jié)加堿量控制反應(yīng)的水解度。酶解液經(jīng)沸水浴10 min滅酶活終止反應(yīng)后，10 000 r/min冷凍分離10 min，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥得產(chǎn)物玉米蛋白肽。

1.3 分析方法

1.3.1 水解度(DH)的測定

采用 pH-stat法［11］。

水解度計算公式:

其中:B，消耗堿量(mL);N，NaOH摩爾濃度(mol/L);α，氨基的平均解離度，α=［10(pH－pK)］/［1+10(pH-pK)］，其中pK為氨基的平均解離常數(shù)，按7.0算，pH為反應(yīng)起始pH值;htot，單位質(zhì)量底物蛋白質(zhì)中肽鍵的摩爾數(shù)，對于玉米蛋白 h=7.35 mmol/g;MP的為底物中蛋白質(zhì)總量(g)。

1.3.2 乙醇脫氫酶活性的測定［12］

本試驗采用改良的Valle＆Hoch法測定乙醇脫氫酶(ADH)的活性。在測定管中分別加入焦磷酸鈉緩沖液1.5mL(pH值8.8)、0.027mol/L氧化型輔酶I(NAD+)1.0mL，11.5%(V/V)的乙醇溶液0.5mL，0.1mg/mL試驗樣品溶液0.1mL，混合后，放入25℃的水浴鍋中，加蓋溫育5 min。之后向測定管中加入ADH(0.25 U/mL)0.1mL，搖勻后立即用分光光度計測定其吸光度(A340nm)值，以后每隔10 s讀數(shù)一次，直至每分鐘吸光度的增大值達(dá)到穩(wěn)定為止。以A值對時間作圖，計算 A340nm/10 s的增加值，根據(jù)NADH在340 nm處的摩爾吸光系數(shù)為6.2，計算酶活力單位。ADH的活性以每分鐘NADH生成的納摩爾數(shù)表示，計算公式如下:

1.3.3 乙醛脫氫酶活性的測定［13］

采用改良的Blair＆Bodley方法。在測定管中分別加入100 mmoL焦磷酸鈉緩沖液1.6mL(pH值9.5)、3.6 mmoL氧化型輔 I(NAD+)1.0mL，100 mmoL乙醛溶液0.1mL，10 mmoL吡唑0.1mL，0.1mg/mL試驗樣品溶液0.1mL，混合后，放入30℃的水浴鍋中，加蓋溫育5 min。之后向測定管中加入18 mmoL ALDH 0.1mL，搖勻后立即用分光光度計測定其吸光度(A340nm)值，以后每隔1 min讀數(shù)1次，直至每分鐘吸光度的增大值達(dá)到穩(wěn)定為止。以A值對時間作圖，計算A340nm/1 min的增加值，根據(jù)NADH在340 nm處的摩爾吸光系數(shù)為6.2，計算酶活力單位。ALDH的活性以每分鐘NADH生成的納摩爾數(shù)表示，計算公式如下:

1.3.4 氨基酸分析

采用Waters美國高效液相色譜，PICO.TAG氨基酸分析，柱分別測定了濃縮玉米蛋白粉和玉米肽的氨基酸組成，由華南理工大學(xué)測試中心測定。

1.3.5 肽相對分子量分布

酶解物溶液經(jīng)0.45 μm微孔過濾膜過濾后上TSKgel 2000色譜柱，以牛胰島素(MW5733.49)、氧化型谷胱甘肽 (MW612.23)、還原型谷胱甘肽(MW307.3)為標(biāo)準(zhǔn)品，測定酶解物的相對分子質(zhì)量分布。高效液相色譜儀條件:Waters 600(配2487紫外檢測器和M32工作站);色譜柱為TSK gel 2000 SWXL［(300 ×7.8)mm］;流動相為乙腈-水-三氟乙酸體積比45∶55∶0.1;檢測波長為220 nm;流速為0.5mL/min;柱溫為30℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解物對乙醇脫氫酶(ADH)活力的激活作用

乙醇主要在肝臟內(nèi)代謝，在肝內(nèi)代謝主要有3條途徑，分別由不同酶系催化，正常情況下進(jìn)入體內(nèi)的乙醇90%以上是在脫氫酶系統(tǒng)-ADH和ALDH的催化作用下完成代謝的［14］。

Yokoyama指出，乙醇首先在胃腸內(nèi)的代謝與胃內(nèi)ADH的活性有關(guān)，提高ADH的活性可減輕乙醇對機(jī)體的毒害作用［15］。本實驗首先對玉米肽在體外對ADH的活性的影響進(jìn)行了測定。水解度與ADH激活率的關(guān)系如圖1所示。

圖1 反應(yīng)水解度對產(chǎn)物ADH激活率的影響

由圖1可知，產(chǎn)物的ADH激活率與反應(yīng)水解度密切相關(guān)。當(dāng)控制反應(yīng)水解度在10%～22.7%，酶解產(chǎn)物粗肽的ADH激活率隨著水解度增加而增加，ADH最大激活率為27.1%。

2.2 酶解產(chǎn)物對乙醛脫氫酶(ALDH)活力的激活作用

乙醛是乙醇代謝后的產(chǎn)物，它可與肝細(xì)胞成分結(jié)合產(chǎn)生毒性，而且乙醛比乙醇對肝毒性更強(qiáng)。在肝細(xì)胞線粒體內(nèi)乙醛被ALDH氧化為乙酸，當(dāng)ALDH活性降低時，未被氧化的乙醛進(jìn)入血內(nèi)，通過黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)變?yōu)槌趸?，?dǎo)致脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜脂質(zhì)，促進(jìn)肝損傷［16］。ALDH活性的高低是玉米肽解酒活性的重要表征。酶解物不同水解度與ALDH激活率的關(guān)系如圖2所示。

圖2 反應(yīng)水解度對產(chǎn)物ALDH激活率的影響

產(chǎn)物的ALDH激活率與反應(yīng)水解度密切相關(guān)。當(dāng)控制反應(yīng)水解度在10%～22.7%，酶解產(chǎn)物粗肽的ALDH激活率隨著水解度增加而增加，ALDH最大激活率為50.0%。

體外實驗表明玉米肽對ADH，ALDH均有良好的激活作用。

2.3 玉米肽的氨基酸組成

本實驗同時對水相中酶解所得的玉米肽(水解度為 23.0%)［17］及非水相中酶解物(水解度為22.7%)的氨基酸組成進(jìn)行了測定，分析結(jié)果見表1。

表1 玉米濃縮蛋白粉及玉米肽氨基酸組成成分分析(mol/%)

由表1可知，濃縮玉米蛋白及玉米肽中氨基酸組成與Yamaguchi的測值［5］比較，濃縮玉米蛋白和玉米肽中的Ala含量低于文獻(xiàn)值，但Leu含量比文獻(xiàn)值高，濃縮蛋白與玉米肽的Leu含量分別比文獻(xiàn)值高1.43 mol%、3.64 mol%。Yamaguchi認(rèn)為玉米肽的醒酒活性之所以優(yōu)于小麥肽、豌豆肽，是因為它能顯著提高血清中Ala和Leu的濃度，尤其是Leu的濃度［5］。控制水相中與非水相中玉米蛋白酶解反應(yīng)制取基本相同水解度的酶解物時，非水相中制取的酶解物的Ala、Leu及Pro含量均比水相中制備的酶解物中的高，分別高1.02 mol%，3.18 mol%及1.39 mol%。因此，本試驗體系下所獲得的玉米肽富含Ala、Leu及Pro，具有高體外醒酒活性。

由表2可知，水相中制備的酶解物的游離氨基酸總量高于非水相中制備的酶解物的游離氨基酸總量，且非水相中酶解物的Ala、Leu及Pro含量均比水相中制備的酶解物中的低，但Ala、Leu及Pro總量均比水相中制備的酶解物中的高，說明非水相中酶解物的Ala、Leu及Pro更多地存在于肽中。至于對乙醇代謝起促進(jìn)作用的是肽還是游離氨基酸，還需要進(jìn)一步的實驗研究。

表2 酶解物的游離氨基酸組成(mg/g pro)

2.4 玉米蛋白酶解物的分子量分布

采用高效液相色譜法測定該水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量以及分子質(zhì)量分布，以確定該產(chǎn)物的特征。

圖3 玉米蛋白水解物的分子量分布圖

表3 玉米蛋白水解物分子質(zhì)量分布表

如圖3和表3所示，玉米蛋白酶解物的分子質(zhì)量集中在63～3 548 u，此肽段面積占90%以上，其中分子量＜1 295 u的肽含量最多，約占80%，以2～10肽為主。

3 結(jié)論

非水相中固定化酶對玉米蛋白進(jìn)行酶解所得的玉米小肽類物質(zhì)具備較好的醒酒活性。在體外試驗中，玉米肽對ADH及對ALDH活力均有促進(jìn)作用，當(dāng)控制水解度最高為22.7%時，玉米肽對ADH和ALDH的激活作用最高，達(dá)27.1%、50.0%。非水相中制備的玉米小肽類物質(zhì)含有較高比例的Ala、Leu及Pro，尤其是Leu含量，酶解產(chǎn)物以2～10肽為主。

若能進(jìn)一步提高固定化酶的活力，提高非水相中玉米蛋白的酶解效率，將對醒酒多肽的制備提供一條新穎高效的途徑。

［1］權(quán)文吉.酸性蛋白酶水解玉米蛋白粉的研究［D］.大連理工大學(xué)，2007.

［2］Li Xiu-xia，Han Lu-jia，Chen Long-jian.In vitro antioxidant activity of protein hydrolysates prepared from corn gluten meal［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2008，88:1 660－1 666.

［3］Mills ENC.Biochemical interactions of food derived peptides［J］.Trends Food Sci Technology，1992，3:64－68.

［4］Yamaguchi M，Nishikiori F，Michiko I，et al.The effects of corn peptide ingestion on facilitating alcohol metabolism in healthy men［J］.Biosci Biotecm，1997，61(9):1 474－1 481.

［5］Yamaguchi M，Nishikori F YoshidaM，et a1.Water soluble vegetable oligopep tides:comparative study on alcohol metabolism and plasma amino acid concentrations instrokeprone spontaneously hypertensive rats［J］.Food Biochem，1998，22(3):227－244.

［6］Yamaguchi M，Nishikori F，Ito M，et a1.Effect of corn peptide on alcohol metabolism and plasma free amino acid concentrations in healthy men［J］.Eur J Clin Nutr，1996，50(10):682－688.

［7］王淑媛，王素英.中性蛋白酶酶解玉米肽及其醒酒活性研究［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(04):60－63.

［8］張春紅，陳海英，韓曉芳，等.海藻酸鈉固定化谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶穩(wěn)定性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2006，27(9):69－71.

［9］郭平.低分子量玉米肽的制備分離純化及其生理活性的研究［D］.吉林大學(xué)，2007.

［10］徐力，李相魯，吳曉霞，等.一種新的玉米氧化肽的制備與結(jié)構(gòu)表征［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2004，25:466－469.

［11］Jens Adler Nissen.Enzymatic hydrolysis of food protein［M］.Essex:Elsevier Applied Science Publishers LTD，1986:122－144.

［12］B·施特爾馬赫.酶的測定方法［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1992:17－19.

［13］Blair A H，Bodley F H Human liver aldehyde dehydrogenase:Partial purification and properties［J］.Can J Biochem，1969，47:265－272.

［14］林振濤，于紅燕.酒的代謝與中毒［J］.濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1999，22(3):311－312.

［15］Yocoyama H，Baraona E，Lierber S.Upstream structrure of human ADH7 gene and the organ distribution of its expression ［J］.Biochem Biophys Commun，1995，215(1):251－272.

［16］陳子馨，王泰齡，趙靜波，等.酒精性大鼠肝損傷中酶組織化學(xué)反應(yīng)的觀察［J］.中日友好醫(yī)院學(xué)報，1996，10(3):197－200.

［17］吳暉，王蓓蓓，李麗麗，等.玉米粗肽的可控酶法制備及其體外醒酒活性的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(9):88－91.

Preparation of Corn Peptide in Nonaqueous Media and Its Antialcoholism Activity in vitro

Wu Hui，Li Li-li，Li Xiao-feng，Yu Yi-gang
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

Crude corn peptides were prepared via immobilized enzymatic hydrolysis of corn proteins in nonaqueous media，and its alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase activities in vitro were studied.Amino acids composition and relative molecular weight distribution of the peptides were analyzed.Results showed that the highest alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase activation ratio were 27.1%and 50.0%，respectively，when the hydrolysis degree reached 22.7%.Corn peptides contained high proportion of alanine，praline and leucine，especially leucine.Molecular weight of enzymatic hydrolysis products were less than 3 548 u，the most were below 1295 Da，taking up about 80%，mainly be 2～10 peptides.

nonaqueous media，immobilization，corn peptides，antialcoholism activity

博導(dǎo)，教授(李曉鳳為通訊作者)。

*國家自然科學(xué)基金項目(20906031)，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET－060746)，教育部高校博士點(diǎn)專項科研基金(200805611022)

2009－12－07，改回日期:2010－05－21