樹干畢赤酵母菌對內(nèi)醚糖的利用*

代江紅，余志晟，王曉燕，張洪勛

1(中國科學(xué)院研究生院資源與環(huán)境學(xué)院，北京，100049)2(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100083)

樹干畢赤酵母菌對內(nèi)醚糖的利用*

代江紅1，余志晟1，王曉燕2，張洪勛1

1(中國科學(xué)院研究生院資源與環(huán)境學(xué)院，北京，100049)2(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100083)

研究了樹干畢赤酵母菌(Pichia stipitis)對內(nèi)醚糖的利用及發(fā)酵產(chǎn)乙醇的情況。結(jié)果表明，與對葡糖糖的利用相比，樹干畢赤酵母菌利用內(nèi)醚糖的效率較低，且不能發(fā)酵產(chǎn)乙醇。然而，在內(nèi)醚糖和葡萄糖同時存在的情況下，內(nèi)醚糖可促進樹干畢赤酵母的生長，乙醇產(chǎn)率也獲得提高。在 YPD培養(yǎng)基中添加0.1% 內(nèi)醚糖，細胞濃度和乙醇產(chǎn)率最高，其中細胞濃度提高14.3%，乙醇產(chǎn)率提高25.4%。

內(nèi)醚糖，樹干畢赤酵母菌，乙醇發(fā)酵

利用纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)燃料乙醇，在解決能源問題和環(huán)境污染方面有巨大潛力［1－2］。然而由于纖維素結(jié)構(gòu)致密復(fù)雜，很難通過酶法將其分解成可發(fā)酵的單糖，這阻止了纖維素的乙醇轉(zhuǎn)化［3］。一些研究發(fā)現(xiàn)，纖維素在一定的熱解條件(高溫、缺氧)下可生成以內(nèi)醚糖(Levoglucosan，1，6-脫水-β-D-吡喃葡萄糖，簡稱LG)為主的熱解產(chǎn)物［4－5］。而以內(nèi)醚糖作為微生物的有效底物進行生物轉(zhuǎn)化，無疑為纖維素生物質(zhì)的乙醇轉(zhuǎn)化提供了一條新途徑。

目前，研究人員已從自然界篩選獲得了部分能直接同化內(nèi)醚糖的微生物菌株，并實現(xiàn)了對某些產(chǎn)品的內(nèi)醚糖生物直接轉(zhuǎn)化，如衣康酸、檸檬酸的生產(chǎn)［6－7］;而且進一步發(fā)現(xiàn)不少真菌能通過一種內(nèi)醚糖激酶催化內(nèi)醚糖，生成 6-磷酸葡糖，進入糖代謝被利用［8－10］。然而目前已發(fā)現(xiàn)的真菌利用內(nèi)醚糖的效率普遍較低，原因是內(nèi)醚糖激酶對內(nèi)醚糖的親和力較低，Km高達 48～102 mmol/L［11］;另外，現(xiàn)有的釀酒酵母菌很少能利用內(nèi)醚糖。Prosen［5］等篩選到1株釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae NRRL Y132)能直接發(fā)酵內(nèi)醚糖產(chǎn)乙醇，但是對內(nèi)醚糖的轉(zhuǎn)化率只有葡萄糖的1/3。Nakagawa［6］等篩選了 6株畢赤酵母菌(Pichia spp.)，發(fā)現(xiàn)1株能利用內(nèi)醚糖，但不產(chǎn)乙醇，以及17株酵母菌(Saccharomyces spp.)不能利用內(nèi)醚糖。本課題組以內(nèi)醚糖為唯一碳源對中國3大微生物菌種庫(CGMCC，ACCC，CICC)的89株菌株進行了內(nèi)醚糖的同化能力篩選［12］，其中41株為釀酒酵母菌，均無利用內(nèi)醚糖的能力，篩出的1株具有較強內(nèi)醚糖同化能力的斯達油脂酵母菌(Lipomyces starkeyi YZ－215)菌發(fā)酵內(nèi)醚糖時不產(chǎn)乙醇。最近，本課題組分離、純化了它的內(nèi)醚糖激酶，并成功克隆、表達了內(nèi)醚糖激酶基因［13－14］。把內(nèi)醚糖激酶的氨基酸序列提交到NCBI進行BLASTP檢索，發(fā)現(xiàn)樹干畢赤酵母菌(P.stipitis)有內(nèi)醚糖激酶基因。這暗示樹干畢赤酵母菌能利用內(nèi)醚糖。

課題組研究樹干畢赤酵母菌對內(nèi)醚糖的單獨利用及發(fā)酵，以及與葡萄糖的混合發(fā)酵，旨為內(nèi)醚糖作為樹干畢赤酵母菌的一種發(fā)酵添加劑提供實驗依據(jù)，進而為內(nèi)醚糖作為真菌的一種發(fā)酵添加劑提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

樹干畢赤酵母菌(P.stipitis NBRC 10063=CBS 6054):購自日本技術(shù)評價研究所生物資源中心(Biological Resource Center，National Institute of Technology and Evaluation)。

YPD培養(yǎng)基(g/L):酵母粉 10，蛋白胨 20，葡萄糖20，瓊脂20;液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

YPLG培養(yǎng)基(g/L):酵母粉10，蛋白胨20，內(nèi)醚糖20，瓊脂20;液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):YPD液體培養(yǎng)基，YPLG液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

UV－4802H紫外分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司;高效液相色譜(HPLC):檢測器:RID－10A示差檢測器;分析柱:Transgenomic ICSep ICE－ORH－801柱(300 mm×6.5 mm)日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樹干畢赤酵母菌對內(nèi)醚糖的利用實驗

樹干畢赤酵母菌于YPD平板上活化，然后接種于YPD液體培養(yǎng)基，30℃ 過夜振蕩培養(yǎng)。分別在YPD、YPLG固體培養(yǎng)基劃線接種，置于恒溫培養(yǎng)箱，30℃ 培養(yǎng)2 d后觀察菌落生成情況。同時樹干畢赤酵母菌按照1% 的接種量分別接種到含有20mL YPD、YPLG的100mL三角瓶中，30℃，200 r/min的恒溫搖床上培養(yǎng)。每2 h取樣，測定OD值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制樹干畢赤酵母菌的生長曲線。

1.3.2 樹干畢赤酵母菌內(nèi)醚糖發(fā)酵實驗

活化后的樹干畢赤酵母菌接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)16～17 h，按1% 的接種量接種到含有 20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，30℃，130 r/min的恒溫搖床上培養(yǎng)。48 h后測乙醇濃度。

1.3.3 內(nèi)醚糖對樹干畢赤酵母菌生長影響的測定

將在YPD液體培養(yǎng)基中活化的菌種，按1% 的接種量接種在 20mL含有不同內(nèi)醚糖濃度(0、0.1%、0.3%、0.5%)的 YPD液體培養(yǎng)基的 100mL三角瓶中，30℃、200 r/min的恒溫搖床上培養(yǎng)。每隔2 h測其OD值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.3.4 內(nèi)醚糖對樹干畢赤酵母菌發(fā)酵影響的測定

將在YPD液體培養(yǎng)基中活化的菌種，按照1%的接種量接種在20mL含有不同內(nèi)醚糖濃度(0、0.1%、0.3%、0.5%)的 YPD液體培養(yǎng)基的 100mL三角瓶中，在 30℃、130 r/min的恒溫搖床上培養(yǎng)。48 h發(fā)酵完畢后測定乙醇濃度。

1.3.5 分析方法

細胞濃度采用分光光度計比色法，用細胞在600 nm的OD值表示。葡萄糖、內(nèi)醚糖和乙醇的含量采用高效液相色譜(HPLC)。分析樣品，每次取樣100μL，用微孔濾膜(φ 0.45 μm)過濾培養(yǎng)液，取 10μL濾液進行HPLC分析。流動相采用5 mmol H2SO4溶液，流速0.6mL/min，溫度50℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹干畢赤酵母菌對內(nèi)醚糖的利用

培養(yǎng)2 d后，樹干畢赤酵母菌在內(nèi)醚糖培養(yǎng)基(YPLG)的菌落小于在葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)上的菌落(沒有顯示)。這表明，樹干畢赤酵母菌可以利用內(nèi)醚糖，但其利用能力低于利用葡萄糖的能力。圖1顯示，在液體培養(yǎng)基中，樹干畢赤酵母菌在以內(nèi)醚糖為碳源的培養(yǎng)基中的生長不如在葡萄糖培養(yǎng)基中，細胞濃度明顯低于在葡萄糖培養(yǎng)基中的細胞濃度，并且很到達快對數(shù)期、穩(wěn)定期。在穩(wěn)定期，內(nèi)醚糖培養(yǎng)基中的細胞濃度大約占葡萄糖培養(yǎng)基中的38%。這說明像其他真菌一樣，樹干畢赤酵母菌的內(nèi)醚糖激酶對內(nèi)醚糖的親和力較低，Km較高。

圖1 樹干畢赤酵母菌在葡萄糖和內(nèi)醚糖液體培養(yǎng)基中的生長曲線

2.2 樹干畢赤酵母菌內(nèi)醚糖發(fā)酵實驗

盡管樹干畢赤酵母菌能利用內(nèi)醚糖，發(fā)酵實驗顯示內(nèi)醚糖發(fā)酵沒有乙醇產(chǎn)生。測定發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，結(jié)果顯示YPD培養(yǎng)基在發(fā)酵前后，其pH基本保持不變，而樹干畢赤酵母菌內(nèi)醚糖發(fā)酵后，培養(yǎng)基的pH由酸性變?yōu)槠珘A性(表1)。由于乙醇發(fā)酵是酸性環(huán)境，因此，培養(yǎng)基的 pH改變可能是導(dǎo)致樹干畢赤酵母菌內(nèi)醚糖發(fā)酵不產(chǎn)乙醇的原因。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基的pH變化

2.3 內(nèi)醚糖對樹干畢赤酵母菌的生長和發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響

圖2顯示，YPD培養(yǎng)基加入內(nèi)醚糖后，樹干畢赤酵母菌的細胞濃度有所提高。當(dāng)內(nèi)醚糖的濃度為0.1% 時，細胞濃度最高，提高14.3%。

圖3顯示，YPD培養(yǎng)基加入內(nèi)醚糖后發(fā)酵，乙醇產(chǎn)率有所提高。添加0.1% 的內(nèi)醚糖，細胞濃度提高8.3%，乙醇產(chǎn)率最大提高25.4%。內(nèi)醚糖對樹干畢赤酵母菌生長和發(fā)酵的影響是一致的，這可能是內(nèi)醚糖促進樹干畢赤酵母菌的生長、細胞數(shù)量增加，導(dǎo)致細胞高密度發(fā)酵，提高了乙醇產(chǎn)率。值得注意的是，發(fā)酵結(jié)束后，內(nèi)醚糖的濃度幾乎沒有發(fā)生變化。

圖2 內(nèi)醚糖對樹干畢赤酵母菌生長的影響

圖3 內(nèi)醚糖對樹干畢赤酵母菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響

3 討論

研究人員一直想篩選到能利用內(nèi)醚糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的酶母菌株，提高纖維素生物質(zhì)熱解產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化。然而，大多數(shù)釀酒酵母菌都不能利用內(nèi)醚糖，或者利用率較低，能利用內(nèi)醚糖的酵母菌卻不能產(chǎn)乙醇。本課題組克隆到真菌利用內(nèi)醚糖的內(nèi)醚糖激酶基因，BLASTP檢索發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌不含內(nèi)醚糖激酶基因，而能發(fā)酵葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇的樹干畢赤酵母菌含有內(nèi)醚糖激酶基因。然而，實驗顯示樹干畢赤酵母菌可以利用內(nèi)醚糖，但利用效率較低，且發(fā)酵內(nèi)醚糖不產(chǎn)乙醇。

內(nèi)醚糖發(fā)酵完后，培養(yǎng)基的pH值由酸性變?yōu)閴A性。培養(yǎng)基的pH值改變可能是導(dǎo)致樹干畢赤酵母菌發(fā)酵內(nèi)醚糖不產(chǎn)乙醇的原因。除具有較高的Km之外，真菌內(nèi)醚糖還具有較高的最適(pH值9.0)，pH 值 7.0 時酶活不到 pH 值 9.0 時的 50%［9，13］。Luyen［15］等人的研究表明，內(nèi)醚糖可促進微球藻的生長，最高生長量可達150%。本研究也發(fā)現(xiàn)內(nèi)醚糖對樹干畢赤酵母菌的生長和發(fā)酵產(chǎn)乙醇有一定的促進作用。作者［16］曾提出真菌內(nèi)醚糖激酶可能是細胞壁的一種周期蛋白。內(nèi)醚糖很可能是通過誘導(dǎo)內(nèi)醚糖激酶，導(dǎo)致細胞壁循環(huán)代謝相關(guān)酶的產(chǎn)生，促進細胞壁的快速循環(huán)和細胞生長，提高細胞濃度，造成高密度發(fā)酵，從而提高乙醇產(chǎn)率。因此，在利用樹干畢赤酵母菌發(fā)酵纖維素酸水解產(chǎn)物生產(chǎn)乙醇的過程中，可以考慮添加內(nèi)醚糖以提高乙醇產(chǎn)率。另外，由于真菌內(nèi)醚糖激酶對內(nèi)醚糖的親和力較低，真菌對葡萄糖的利用明顯高于內(nèi)醚糖，因此，內(nèi)醚糖是否能作為其它真菌的發(fā)酵添加劑值得深入研究。

4 結(jié)論

樹干畢赤酶母菌可以利用內(nèi)醚糖，但與葡萄糖相比，內(nèi)醚糖的利用率低相對均干畢赤酶母菌發(fā)酶內(nèi)醚糖后，培養(yǎng)基的pH值由酸性變?yōu)閴A性，同時不產(chǎn)乙醇;內(nèi)醚糖可以促進樹干畢赤酶母菌的生長和乙醇產(chǎn)率的提高，在YPD培養(yǎng)基中添加0.1%內(nèi)醚糖，細胞濃度提高14.3%，乙醇產(chǎn)率提高25.4%。

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Utilization of Levoglucosan by the Yeast Pichia stipitis

Dai Jiang-hong1，Yu Zhi-sheng1，Wang Xiao-yan2，Zhang Hong-xun1
1(College of Resources ＆ Environment，Graduate University of the Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)2(College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)

This investigation focused on the utilization and ethanol fermentation of levoglucosan by the yeast Pichia stipitis.Results revealed that P.stipitis could utilize levoglucosan at a low efficiency compared to glucose，and could not ferment it to ethanol.However，levoglucosan could facilitate the growth of P.stipitis and enhance its ethanol production when both levoglucosan and glucose existed in culture media.In YPD media with 0.1%levoglucosan，the enhancement of cell concentration and ethanol production was approximately 14.3%and 25.4%，respectively.The results would support that levoglucosan could be used as an additive in high cell density fermentation with P.stipitis.

levoglucosan，Pichia stipitis，ethanol fermentation

博士，講師(余志晟副教授為通訊作者)。

*國家自然科學(xué)基金項目(No.20507021);北京市科學(xué)技術(shù)委員會科技新星項目(2006A2156)

2010－08－01，改回日期:2010－09－27