桑葉多酚氧化酶的固定化及酶學(xué)性質(zhì)研究

楊 洋,黃 濤,關(guān)紅艷,吳小玉

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530004; 2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004)

桑葉多酚氧化酶的固定化及酶學(xué)性質(zhì)研究

楊 洋1,黃 濤2,關(guān)紅艷2,吳小玉1

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530004; 2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004)

研究了桑葉多酚氧化酶(PPO)的動(dòng)力學(xué)特性,結(jié)果表明,其最適溫度為 40℃,最適 pH為 7.0,酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km=0.093mol/L。用濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4%海藻酸鈉、體積分?jǐn)?shù)為 0.2%戊二醛、0.2mol/L的 CaCl2固定多酚氧化酶,固定時(shí)間 2h,交聯(lián)時(shí)間 4h,能使固定化多酚氧化酶的活力達(dá)到最大。固定化酶的最適 pH為 6.0,固定化酶的最佳反應(yīng)溫度為 50℃,固定化酶對(duì)溫度的敏感度降低,溫度變化對(duì)固定化酶酶活力的影響不大。

桑葉,多酚氧化酶,動(dòng)力學(xué),固定化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉 PPO 實(shí)驗(yàn)室自制;考馬斯亮藍(lán) G-250、鄰苯二酚、焦性沒(méi)食子酸、間苯二酚、對(duì)苯二酚、二苯胺、對(duì)氨基苯磺酸、聚乙二醇 20000、十二烷基磺酸鈉(SDS)、丙烯酰胺 (Acr)、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、殼聚糖、醋酸、石蠟、硅藻土、海藻酸鈉、戊二醛、Tween 80、KH2PO4、Na2HPO4等化學(xué)試劑 均為分析純。

掃描電子顯微鏡 S-3400N 購(gòu)自日本日立公司;PL2002電子天平 購(gòu)自特勒-托利多儀器有限公司;UV1240型紫外分光光度計(jì) 購(gòu)自日本島津公司;BECK MAN J2-MC高速冷凍離心機(jī) 購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.2 掃描電子顯微鏡觀測(cè) PPO結(jié)構(gòu)

將桑葉 PPO冷凍干燥樣品固定在觀測(cè)臺(tái)上,然后噴金,以掃描電子顯微鏡 S-3400N觀測(cè) PPO分子形態(tài),同時(shí)觀測(cè)其均一性程度。

1.3 PPO的 SDS-PAGE電泳純度鑒定、分子量測(cè)定

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定酶的純度和測(cè)定分子量。

1.4 酶活性和蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法

1.4.1 桑葉 PPO活性測(cè)定 參照楊昌鵬等人報(bào)道的分光光度計(jì)比色法[7],取磷酸鹽緩沖液 3.9mL,加入0.02mol/L焦性沒(méi)食子酸溶液 1mL,PPO粗酶液0.1mL混勻后在 30℃下反應(yīng) 5min,在 420nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度的變化,每 60s記錄一次OD值隨時(shí)間的變化,以最初直線段的斜率計(jì)算酶活力。一個(gè)酶活力單位定義為：在測(cè)定條件下,每分鐘引起吸光度改變 0.001所需的酶量。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)[8],以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn),在 595nm波長(zhǎng)下測(cè)定酶液的蛋白質(zhì)含量;但在層析過(guò)程中以收集液的吸光光度值 (OD280)來(lái)表示蛋白質(zhì)含量的變化。

1.5 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.5.1 底物專一性 測(cè)定底物專一性時(shí),分別以0.02mol/L的鄰苯二酚、焦性沒(méi)食子酸、間苯二酚、對(duì)苯二酚、二苯胺、對(duì)氨基苯磺酸為底物,測(cè)定 PPO活性。

1.5.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù) Km測(cè)定 取 5組試管,每組 4支試管,1支空白,3支平行管。每支試管分別加入 3.9mL的磷酸鹽緩沖溶液,每組分別加入 30、20、10、5、1mmol/L焦性沒(méi)食子酸為底物,0.1mL酶液,在 30℃條件下反應(yīng) 5min后,測(cè)定 420nm處的吸光度,以反應(yīng)物 420nm處吸光度直接表示活力大小。測(cè)定 PPO活性,根據(jù) Lineweawer-Burk[9]雙倒數(shù)作圖法計(jì)算其Km值。

1.6 桑葉 PPO的固定化

1.6.1 固定化方法

1.6.1.1 樹(shù)脂法 取 0.5g樹(shù)脂AB-8,加入多酚氧化酶 4mg,和磷酸緩沖液 (0.1mol/L,pH6.0)1mL,室溫下,于搖床中振蕩吸附 6h,加入戊二醛至終濃度0.1%,30℃下交聯(lián) 8h,用蒸餾水洗去游離酶和殘余的戊二醛,于 4℃下儲(chǔ)存,備用。

1.6.1.2 硅藻土吸附海藻酸鈉包埋法 分別往適量的硅藻土中加入多酚氧化酶 4mg,和磷酸緩沖液(0.1mol/L,pH6.0)1mL,混合均勻,室溫下,于搖床中振蕩吸附 6h,加入戊二醛至終濃度 0.1%,30℃下交聯(lián) 8h,過(guò)濾洗滌,洗去游離酶和殘余的戊二醛,加入4%海藻酸鈉,混合均勻,用注射器滴入 2%的氯化鈣溶液中,立即可以見(jiàn)到小球形成,且由透明變成白色并沉淀,用濾紙濾出小球體,并用相同的 CaCl2溶液浸泡 2h左右固定化,濾出小球體,操作完畢后,移入4℃的冰箱中硬化 2h,然后用蒸餾水洗滌,加入戊二醛溶液交聯(lián) 4h,再用蒸餾水洗滌,得到固定化酶。于4℃下儲(chǔ)存,備用。

1.6.1.3 殼聚糖微球固定法 稱取適量的殼聚糖微球載體,加入適量的多酚氧化酶液中,30℃下恒溫振蕩 1h,于4℃下放置過(guò)夜,棄去上層溶液,用大量蒸餾水反復(fù)洗滌,洗去游離酶,于 4℃下儲(chǔ)存,備用。

1.6.2 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

1.6.2.1 固定化酶的最適反應(yīng) pH 固定化酶活力測(cè)定體系用 pH分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的一系列緩沖溶液,測(cè)定不同 pH下固定化酶的活力,比較不同 pH下固定化酶和游離酶的最佳反應(yīng)pH。

1.6.2.2 固定化酶的最適反應(yīng)溫度 分別在 20、30、40、50、60、70℃溫度下測(cè)定固定化酶的活力,比較不同溫度下固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 觀測(cè)桑葉 PPO結(jié)構(gòu)

桑葉 PPO的掃描電子顯微鏡觀測(cè)如圖 1所示,從圖中可以看到,PPO酶液經(jīng)過(guò) Sephadex G-75凝膠柱層析分離以后,得到比較均一的結(jié)構(gòu)。同時(shí)也可以看到桑葉 PPO為纖維狀蛋白,根據(jù)觀測(cè)結(jié)果計(jì)算可知,桑葉 PPO分子長(zhǎng)度在 4～12μm之間,寬度在0.5～1.5μm之間。具有酶活性的蛋白質(zhì)通常由幾百個(gè)氨基酸組成,其作用的底物大多數(shù)為小分子,因此酶分子與底物直接發(fā)生作用的僅僅只有一小部分氨基酸側(cè)鏈,這些與酶催化活性有關(guān)的氨基酸側(cè)鏈稱為酶的活性中心。即酶活性中心是指酶與底物結(jié)合并使之反應(yīng)的區(qū)域,一般位于酶分子表面的裂縫或凹槽,往往是疏水區(qū),可容納一個(gè)或多個(gè)小分子底物或大分子底物的一部分,這就是酶的活性中心。從圖 1可以看到,在桑葉 PPO的晶體兩端都有凹槽,應(yīng)為此酶的活性中心。

圖1 掃描電子顯微鏡觀測(cè)桑葉 PPO結(jié)構(gòu)圖

天然狀態(tài)的酶具有完整的三維空間結(jié)構(gòu),其中活性部位跟其他結(jié)構(gòu)部位相比,具有較大的柔性,也就是說(shuō)酶活性部位基因的運(yùn)動(dòng)性較大。當(dāng)?shù)蜐舛茸冃詣┳饔脮r(shí),酶分子整體剛性部分構(gòu)象保持完整,而較柔性的活性部位的局部結(jié)構(gòu)已發(fā)生明顯變化,如活性基團(tuán)的相互靠近和立體取向受到破壞,導(dǎo)致酶活性的喪失。

2.2 桑葉 PPO的純度鑒定及分子量測(cè)定

桑葉 PPO經(jīng)過(guò) Sephadex G-75凝膠層析后,透析,濃縮,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度,見(jiàn)圖 2。發(fā)現(xiàn)只有一條譜帶,說(shuō)明此酶已經(jīng)達(dá)到電泳純。有關(guān)桑葉多酚氧化酶同工酶的鑒定尚待進(jìn)一步研究。

圖2 蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖譜

電泳結(jié)果如圖 2所示,可以看出桑葉 PPO的條帶堆滯在 47kDa附近,因此分子量測(cè)定約為 47kDa。

2.3 PPO酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 PPO的底物專一性 從表 1可以看出,桑葉PPO迅速地催化焦性沒(méi)食子酸的酶促氧化反應(yīng),催化鄰苯二酚的氧化反應(yīng)速率為焦性沒(méi)食子酸的 2.5倍,而對(duì)對(duì)苯二酚、沒(méi)食子酸、間苯二酚、對(duì)氨基苯磺酸的活性較小,對(duì)二苯胺則完全無(wú)催化活性。這表明焦性沒(méi)食子酸為桑葉 PPO的主要氧化底物。

表1 不同底物對(duì)酶活性的影響

2.3.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù) 以焦性沒(méi)食子酸為底物,緩沖液為磷酸鹽緩沖液(pH6.0,0.02mol/L),底物濃度分別為 30、20、10、5、1mmol/L?？偡磻?yīng)體積都為3.9mL。在 30℃下反應(yīng) 5min,以反應(yīng)物 420nm處吸光度測(cè)定酶活。以 1/[S]和 1/V為橫縱坐標(biāo)作Lineweaver-Burk圖 (圖 3)。求得該 PPO催化焦性沒(méi)食子酸水解的 Km為 0.093mol/L。因此,米氏常數(shù)Km值實(shí)際上也是酶與底物親合力大小的反映,即Km值越小,酶與底物的親合力越大。

圖 3 Lineweaver-Burk圖

2.4 PPO的固定化研究

2.4.1 固定化載體的優(yōu)化 從表2看出,樹(shù)脂法吸附性差,不能將 PPO很好地吸附,因此不能將 PPO固定化;采用殼聚糖微球固定法將 PPO固定化,吸附能力過(guò)強(qiáng),通透性也差,固定化酶活性也隨之下降;以硅藻土吸附海藻酸鈉包埋法比殼聚糖微球固定法的效果好,能將 PPO很好地固定。

表 2 不同載體的固定化多酚氧化酶活力

分別往適量的硅藻土中加入 PPO 4mg和磷酸緩沖液(0.1mol/L,pH6.0)1mL,混合均勻,室溫下,于搖床中振蕩吸附 6h,加入戊二醛至終濃度 0.1%(體積分?jǐn)?shù)),30℃下交聯(lián) 8h,過(guò)濾洗滌,洗去游離酶和殘余的戊二醛,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 4%海藻酸鈉,混合均勻,用注射器滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2%的氯化鈣溶液中,立即可以見(jiàn)到小球形成,且由透明變成白色并沉淀,用濾紙濾出小球體,并用相同的 CaCl2溶液浸泡 2h左右固定化,濾出小球體,操作完畢后,移入 4℃的冰箱中硬化 2h,然后用蒸餾水洗滌,加入戊二醛溶液交聯(lián) 4h,再用蒸餾水洗滌,得到固定化酶。

2.4.2 硅藻土吸附海藻酸鈉包埋法固定 PPO條件的優(yōu)化

2.4.2.1 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶活性的影響 從圖 4可以看出,海藻酸鈉濃度低時(shí),酶泄漏嚴(yán)重,清洗固定化酶小球時(shí),酶的損失較多,酶活力下降,酶活力隨海藻酸鈉濃度的增大而提高,當(dāng)海藻酸鈉濃度達(dá)到質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.4%時(shí),酶活力達(dá)到最大值,之后酶活力略有下降,可能是固定化酶負(fù)載量過(guò)大,使得載體強(qiáng)度不夠,酶反而容易泄露。加上海藻酸鈉濃度高時(shí),微環(huán)境效應(yīng)和擴(kuò)散阻力對(duì)反應(yīng)影響更大,且不易操作,很難將酶液從注射器中擠出。故選用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.4%海藻酸鈉對(duì)酶進(jìn)行固定化較為適宜。

圖 4 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶活性的影響

2.4.2.2 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響如圖 5所示,可以看出,當(dāng)固定化時(shí)間為 2h時(shí),固定化酶活力最高,固定化時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng),固定化酶活力均有不同程度的下降。究其原因,固定化酶的活性受到兩個(gè)方面的綜合影響,一方面隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng),多酚氧化酶固化越來(lái)越充分,酶在海藻酸鈣凝膠中包埋得更牢固,有利于固定化酶活力的提高;另一方面,隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng),Ca2+對(duì)固定化酶的抑制作用加劇,使酶活力下降。

圖 5 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響

2.4.2.3 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 6所示,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響較小,固定化酶交聯(lián)不同時(shí)間后,其相對(duì)酶活力均在 75%以上,交聯(lián)時(shí)間為 4h時(shí),固定化乳酸氧化酶相對(duì)酶活力最高,交聯(lián)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短,酶活力均有所下降。這可能是因?yàn)榉肿娱g交聯(lián)反應(yīng)達(dá)飽和后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),開(kāi)始發(fā)生酶分子內(nèi)交聯(lián),增加了酶分子間的空間位阻,直接影響到酶活性中心對(duì)底物的定位作用。且內(nèi)擴(kuò)散阻力也增大,從而使固定化后有部分酶蛋白失活。

圖 6 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響

2.4.3 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.3.1 pH對(duì)固定化酶活性的影響 酶存在于生物體中,具有很高的催化活性。但是它對(duì)于所處的微環(huán)境也有很高的要求。例如溶液的酸堿性對(duì)于酶的活力具有很大的影響。我們實(shí)驗(yàn)了在不同的 pH條件下,液相以及固定化多酚氧化酶的活力,所得結(jié)果如圖7所示。

圖7 pH對(duì)固定化和游離 PPO活性的影響

由圖 7可以看出,固定化酶的最適 pH為 6.0,與游離酶相比,其最適 pH發(fā)生了變化,由 7.0變?yōu)榱?.0。固定化酶的最適 pH較游離酶的最適 pH發(fā)生了偏移,可能由于兩種因素造成：一是載體含有大量帶電基團(tuán),其多電解質(zhì)的微環(huán)境影響著酶的活力;二是由于酶的作用產(chǎn)物導(dǎo)致在固定化酶顆粒內(nèi)建立一種帶電的微環(huán)境。

2.4.3.2 溫度對(duì)固定化酶活性的影響 不同酶的熱穩(wěn)定性不同。在溫度低于最適反應(yīng)溫度時(shí),酶反應(yīng)速度隨著溫度的升高而增加,這時(shí)酶蛋白的熱變性不是主要的;在溫度超過(guò)最適溫度時(shí),反應(yīng)速度反而會(huì)隨著溫度的升高而下降,這時(shí)酶熱變性造成的影響比升溫引起反應(yīng)加速的影響更大。固定化多酚氧化酶最適反應(yīng)溫度曲線和熱穩(wěn)定性曲線分別如圖 8和 9所示。

圖8 溫度對(duì)固定化和游離 PPO活性的影響

圖9 固定化和游離 PPO的熱穩(wěn)定性

圖 8中相對(duì)酶活指不同溫度條件下,加入等量酶液或固定化酶反應(yīng)的表觀酶占其中最大值的百分比。游離酶的活力隨著溫度的上升迅速增大,到達(dá)40℃左右達(dá)到最大,說(shuō)明游離酶的最佳反應(yīng)溫度在40℃。固定化酶的最佳反應(yīng)溫度為 50℃。游離和固定化酶在 40℃之前保持著良好的熱穩(wěn)定性,但是溫度到達(dá) 60℃時(shí),游離酶的活力損失嚴(yán)重,而固定化酶仍然保持著較高的酶活力。由此可見(jiàn),固定化酶對(duì)溫度的敏感度降低,溫度變化對(duì)固定化酶酶活力的影響不大。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)多酚氧化酶性質(zhì)的研究,結(jié)果表明：用掃描電鏡觀察經(jīng)過(guò)分離純化的桑葉多酚氧化酶,其為纖維狀蛋白,分子長(zhǎng)度在 4～12μm之間,寬度在0.5～1.5μm之間。桑葉多酚氧化酶的分子量約為47kDa;最適底物為焦性沒(méi)食子酸;最適 pH為 7.0;最適溫度為 40℃。PPO的 Km值為 0.093mol/L。

研究了桑葉多酚氧化酶的固定化：用濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%海藻酸鈉、體積分?jǐn)?shù)0.2%戊二醛、0.2mol/L的CaCl2固定多酚氧化酶,固定時(shí)間 2h,交聯(lián)時(shí)間 4h,能使固定化多酚氧化酶的活力達(dá)到最大。固定化酶的最適 pH為 6.0,固定化酶的最佳反應(yīng)溫度為 50℃,固定化酶對(duì)溫度的敏感度降低,溫度變化對(duì)固定化酶酶活力的影響不大。

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Study on the immobilization of polyphenol oxidase of mulberry leaf

YANG Yang1,HUANG Tao2,GUAN Hong-yan2,W U X iao-yu1
(1.College ofLife Science and Technology,Nanning 530004,China; 2.College ofLight Industry and Food Engineering.,GuangxiUniversity,Nanning 530004,China)

Kine tic cha rac te ris tics of p olyp henol oxidase(PPO)in m ulbe rry leaf we re s tud ied.The result showed tha t the op t im um pH and temp e ra ture was7.0and40℃,resp ec tive ly,and the M ichae liscons tant was0.093m ol/L.The imm ob iliza tion of PPO from m ulbe rry leaf was resea rched.The ac tivity of imm ob ilized PPO reached its m ax im um when4% sod ium a lg ina te,0.2% g luta ra ldehyde,0.2m ol/Lwe re used to imm ob ilize the PPO,in an mim ob iliza tion t im e of2h and c ross linking t im e of4h.The op t im um pH and temp e ra ture was6.0,and 50℃resp ec tive ly,and the enzym e becam e less suscep tib le to the temp e ra ture,the temp e ra ture d id little affec t to the enzym a tic ac tivity.

m ulbe rry leaf;p olyp henol oxidase;kine tics; imm ob iliza tion

TS201.2+5

A

1002-0306(2010)02-0245-05

多酚氧化酶是遍布動(dòng)植物體內(nèi)的一種胞內(nèi)酶,在植物體內(nèi)主要與抗病等有關(guān)[1-2];在食品保鮮方面,多酚氧化酶(PPO)與果蔬的褐變、黑色素合成有關(guān),它可以氧化多酚成醌,使產(chǎn)品顏色變深,并使風(fēng)味產(chǎn)生一定變化;PPO與昆蟲(chóng)的發(fā)育有密切關(guān)系,可以通過(guò)研究它開(kāi)發(fā)殺蟲(chóng)農(nóng)藥[3]。PPO能促使兒茶素類物質(zhì)氧化形成茶黃素、茶紅素和其它的氧化聚合物,同時(shí)伴隨兒茶素的氧化,氨基酸、胡蘿卜類等香氣前體發(fā)生偶聯(lián)氧化,產(chǎn)生各種各樣的香氣化合物,并形成紅茶的基本風(fēng)味[4]。由于 PPO潛在的應(yīng)用背景及對(duì)人體健康的影響和環(huán)境保護(hù)方面的因素,故對(duì)它的研究具有廣泛的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。人們做了很多的關(guān)于多酚氧化酶的研究工作,其中最受關(guān)注的問(wèn)題集中在不同介質(zhì)及不同溫度、不同條件下的多酚氧化酶的活性研究。但對(duì)于桑葉多酚氧化酶的固定化研究尚未見(jiàn)報(bào)道。桑樹(shù)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物,桑葉不僅是家蠶的最好飼料,而且桑葉和桑根等又自古入藥[5-6]。為此,本文以桑葉 PPO為研究對(duì)象,研究桑葉 PPO酶學(xué)性質(zhì)和固定化,為桑葉PPO的亞細(xì)胞定位及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用桑樹(shù)資源和桑葉多酚氧化酶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

2009-03-23

楊洋(1956-),女,教授,研究方向：天然植物生物活性研究。