牛奶中抗生素殘留檢測(cè)試劑盒的研制及應(yīng)用

謝 莉,程 華,董 超,李志平,朱俊平,閆靜輝,＊

(1.河北省生物研究所,河北石家莊 050081; 2.河北省獸藥監(jiān)察所,河北石家莊 050051; 3.河北三元食品有限公司,河北石家莊 050071)

牛奶中抗生素殘留檢測(cè)試劑盒的研制及應(yīng)用

謝 莉1,程 華1,董 超1,李志平2,朱俊平3,閆靜輝1,＊

(1.河北省生物研究所,河北石家莊 050081; 2.河北省獸藥監(jiān)察所,河北石家莊 050051; 3.河北三元食品有限公司,河北石家莊 050071)

對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的生成、營養(yǎng)基質(zhì)、各成分添加比例等條件進(jìn)行了研究,研制出檢測(cè)牛奶中抗生素殘留的 96孔板試劑盒。此試劑盒對(duì)牛奶中青霉素 G的檢測(cè)極限為 3ng/mL,阿莫西林的檢測(cè)極限為 4ng/mL,頭孢匹林的檢測(cè)極限為8ng/mL。同一批奶樣檢測(cè)結(jié)果證明,此試劑盒與西班牙 ZEU- INMUNOTEC公司同類試劑盒產(chǎn)品質(zhì)量相當(dāng),靈敏度高于國標(biāo) TTC法,適于推廣應(yīng)用。

抗生素殘留,檢測(cè),牛奶,嗜熱脂肪芽孢桿菌

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

120份新鮮原奶樣品 采自石家莊某乳制品廠;無抗奶 光明乳業(yè)股份有限公司;嗜熱脂肪芽孢桿菌 河北省生物研究所保藏;青霉素 G、阿莫西林、頭孢匹林、磺胺嘧啶、頭孢氨芐、四環(huán)素、土霉素、溴甲酚紫 購于 SIG MA公司;ECL IPSE 50試劑盒 西班牙 ZEU- INMUNOTEC公司產(chǎn)品;種子培養(yǎng)液 胰蛋白胨 1%、酵母粉 0.5%、氯化鈉 0.5%,pH7.2;芽孢生成培養(yǎng)基 胰蛋白胨 0.3%、酵母粉 0.4%、氯化鎂0.2%、氯化鈣 0.1%、硫酸錳 10mg/L、瓊脂 1.5%, pH7.2;營養(yǎng)培養(yǎng)基 胰蛋白胨 1%、牛肉膏 0.5%、葡萄糖 1%、瓊脂 0.8%,pH7.2。

S W-CJ-2F凈化臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司; DNP-9052恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芽孢的生成 從斜面上挑取一環(huán)實(shí)驗(yàn)菌接種到盛有 50mL種子培養(yǎng)液的三角瓶中,于 55℃, 120r/min搖床培養(yǎng),達(dá)到對(duì)數(shù)生長期后吸取 1mL菌液到已鋪好的芽孢生成培養(yǎng)基平板中,玻璃棒涂勻,將其置于 60℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定期涂片顯微鏡檢查芽孢生成情況[5-6]。

1.2.2 芽孢的富集 用滅菌的生理鹽水洗下平板上的芽孢,5000r/min離心 10min,傾去上清液,添加生理鹽水洗滌兩次,最后混勻制成芽孢懸液,煮沸20min,殺死營養(yǎng)體,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗生素檢測(cè)試劑盒的制備方法 往融化的營養(yǎng)培養(yǎng)基中,加入溴甲酚紫指示劑和嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢懸液,充分搖勻后用排槍吸取混合液加到96孔板中,待其冷卻后用不干膠封口。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 制備條件的優(yōu)化

1.2.4.1 營養(yǎng)培養(yǎng)基 pH及瓊脂濃度的確定 調(diào)節(jié)營養(yǎng)培養(yǎng)基 pH為 6.5、6.8、6.9、7.0、7.2、7.4等不同值,進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn),待確定合適的 pH后,改變瓊脂濃度為 0.5%、0.8%、1.0%、1.2%,檢測(cè)實(shí)驗(yàn)選擇最佳培養(yǎng)基配方。

1.2.4.2 指示劑濃度的確定 用無水乙醇配制溴甲酚紫溶液濃度為 15mg/mL,再分別吸取 10、20、40、60、80μL添加到 100mL營養(yǎng)培養(yǎng)基中,進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn),確定指示劑的最佳加入量。

1.2.4.3 芽孢濃度的確定 添加不同比例的芽孢懸液到營養(yǎng)培養(yǎng)基中,進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn),以確定體系中需要加入的芽孢量。

1.2.5 試劑盒均一度檢測(cè) 取出抗生素檢測(cè)試劑盒,其中 48孔加入 50μL無抗奶作為陰性對(duì)照,48孔加入 50μL含 10mg/mL青霉素的牛奶作為陽性對(duì)照,微孔密封好后置于 65℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時(shí)間后,從微孔側(cè)面觀察,根據(jù)顏色變化進(jìn)行結(jié)果判斷。

1.2.6 檢測(cè)結(jié)果的判斷依據(jù) 黃色到黃綠色為陰性結(jié)果范圍;藍(lán)紫色為陽性結(jié)果范圍;當(dāng)檢測(cè)結(jié)果顏色界于陰性、陽性之間時(shí),如淡藍(lán)色為可疑結(jié)果,是本試劑盒的檢測(cè)極限。

1.2.7 不同抗生素的檢測(cè)靈敏度分析 選用不同的抗生素,用無抗奶配制成不同濃度,取 50μL用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與規(guī)定的最大殘留限制(MRL)進(jìn)行比對(duì)(濃度配制根據(jù)不同抗生素的MRL規(guī)定,在范圍上下采用 1ng或 10ng級(jí)別遞增或遞減)。

我幼年開始每天早起，多年下來養(yǎng)成了早晨5點(diǎn)半左右起床的習(xí)慣，也就每天早晨“多出了”兩個(gè)小時(shí)讀書寫作、思考工作。晚上睡前也會(huì)盡可能擠出時(shí)間閱讀。長期以往養(yǎng)成了習(xí)慣，不讀書就會(huì)若有所失，甚至?xí)小白飷焊小薄Ｈ绻欢螘r(shí)間讀書少了，我就會(huì)盡可能安排相對(duì)多一些的時(shí)間集中閱讀，求得平衡。

1.2.8 穩(wěn)定性分析 制備好的試劑盒密封好后置于4℃保存 0、30、60、90、180d后,分別記錄其陰性檢測(cè)時(shí)間。

1.2.9 試劑盒的評(píng)價(jià) 從石家莊某乳制品廠采集新鮮原奶樣品 120份,采用實(shí)驗(yàn)研制的試劑盒進(jìn)行檢測(cè),并與西班牙 ZEU- INMUNOTEC公司生產(chǎn)的ECL IPSE 50試劑盒及國標(biāo) TTC法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢懸浮液的制備

嗜熱脂肪芽孢桿菌在種子培養(yǎng)液中培養(yǎng) 14～16h后達(dá)到對(duì)數(shù)生長期,將種子液涂布到芽孢生成培養(yǎng)基平板中,60℃培養(yǎng) 6h后,開始出現(xiàn)芽孢,培養(yǎng) 24h后顯微鏡觀察芽孢生成率達(dá)到 90%以上。用生理鹽水洗下芽孢,煮沸殺死營養(yǎng)體,通過稀釋平板計(jì)數(shù)法,調(diào)整懸液的體積,使芽孢數(shù)量達(dá)到109個(gè) /mL。

圖1 嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢

2.2 營養(yǎng)培養(yǎng)基 pH及瓊脂濃度的確定

溴甲酚紫指示劑的變色范圍是 pH5.2～6.8,考慮在營養(yǎng)培養(yǎng)基的 pH接近指示劑的檢測(cè)極限時(shí),芽孢萌發(fā)產(chǎn)酸可使指示劑顏色更好地發(fā)生變化,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),pH變化對(duì)反應(yīng)變色時(shí)間沒有明顯的影響。在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基滅菌前 pH為 6.5、6.8和 6.9時(shí),制備成孔板后,微孔顏色為紫紅色;pH為 7.0、7.2和 7.4時(shí)微孔中培養(yǎng)基呈現(xiàn)藍(lán)紫色,考慮到滅菌過程中 pH的降低,以及嗜熱脂肪芽孢桿菌生長所需的pH,故選擇營養(yǎng)培養(yǎng)基 pH為 7.2。

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),營養(yǎng)培養(yǎng)基中瓊脂濃度越低,微孔檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間越短,但瓊脂濃度過低,基質(zhì)過于柔軟,不利于保存與運(yùn)輸,故選擇營養(yǎng)培養(yǎng)基瓊脂濃度為0.8%。

2.3 指示劑濃度的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,指示劑的添加量為每 100mL培養(yǎng)基添加 10、20μL時(shí),檢測(cè)微孔內(nèi)的瓊脂培養(yǎng)基顏色過淺,不利于判斷;而添加量過多時(shí)則可能會(huì)對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌的生長造成影響,因此,最后確定每100mL培養(yǎng)基中加入指示劑 40μL,這時(shí)微孔顯色效果較好,均呈現(xiàn)藍(lán)紫色。

2.4 芽孢濃度的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢濃度過低,培養(yǎng)后產(chǎn)酸太少不能使指示劑發(fā)生顏色變化,而加入量過高后,容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn),確定芽孢懸液加入量為1%。

2.5 試劑盒均一度檢測(cè)

經(jīng) 65℃培養(yǎng) 2.5h后,加入無抗奶的 48孔均變?yōu)榧冋狞S色,而加入有抗奶的 48孔仍為藍(lán)紫色。所有微孔顏色均勻,無漏孔現(xiàn)象。

2.6 常用藥物檢測(cè)限

使用該試劑盒對(duì)牛奶中常見的 6種抗生素殘留進(jìn)行檢測(cè),依據(jù)顏色變化進(jìn)行判斷,結(jié)果見表 1。由表 1中可以看出,嗜熱脂肪芽孢桿菌 96孔板法能檢測(cè)出牛奶中多種抗生素,并且低于規(guī)定的最大殘留檢測(cè)限[7-8]。

表 1 96孔板法檢測(cè) 6種藥物殘留的結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性分析

由于芽孢有一個(gè)衰減的過程,故芽孢數(shù)量會(huì)有一定的減少,陰性檢測(cè)時(shí)間會(huì)隨著時(shí)間的延長有所變化。表 2為試劑盒存放不同時(shí)間陰性檢測(cè)結(jié)果。從中可以看出,陰性檢測(cè)時(shí)間變化較小,試劑盒在4℃保存 6個(gè)月后,檢測(cè)時(shí)間只延長了 10min,說明本試劑盒能夠保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。同時(shí)為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,每次實(shí)驗(yàn)需作陰性對(duì)照,以此來確定加熱培養(yǎng)所需的最佳時(shí)間。

表2 試劑盒穩(wěn)定性測(cè)試

2.8 試劑盒的應(yīng)用

從表 3可以看出,檢測(cè)同一批樣品 (n=120),用本試劑盒與西班牙 ZEU- INMUNOTEC公司生產(chǎn)的ECL IPSE 50試劑盒的檢測(cè)結(jié)果完全相同,兩者陽性檢出率都為 3.33%,高出國標(biāo) TTC法陽性檢出率1.67個(gè)百分點(diǎn),說明本試劑盒靈敏度達(dá)到國外同類試劑盒檢測(cè)水平,效果好于常用的 TTC法。

表3 試劑盒的應(yīng)用結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以嗜熱脂肪芽孢桿菌為指示菌,溴甲酚紫為指示劑,輔以合適的營養(yǎng)基質(zhì),研制了檢測(cè)抗生素殘留的試劑盒。為了提高檢測(cè)方法的靈敏度和穩(wěn)定性,在芽孢和指示劑的含量、營養(yǎng)基質(zhì)的配方等方面進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)。研制的試劑盒對(duì)牛奶中常見的β-內(nèi)酰氨類、磺胺類、四環(huán)素類等抗生素藥物具有較好的檢測(cè)靈敏度,在 6個(gè)月的保存期內(nèi),具有較好的檢測(cè)穩(wěn)定性。采用該試劑盒與西班牙 ZEUINMUNOTEC公司生產(chǎn)的 ECL IPSE 50試劑盒檢測(cè)同一批樣品、兩者檢測(cè)結(jié)果完全相同,說明該試劑盒與國外同類試劑盒質(zhì)量相當(dāng),但我們研制的試劑盒有很大的價(jià)格優(yōu)勢(shì),利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。同時(shí)與 TTC法相比,該試劑盒操作簡(jiǎn)便靈活,使用的 96微孔板可以獨(dú)立分拆,奶樣不用預(yù)處理,只需要一步操作即可完成,且結(jié)果直觀易懂,省去了 TTC法復(fù)雜的前處理工作。因此本試劑盒可以應(yīng)用于牛奶中抗生素殘留的檢測(cè),適合于牧場(chǎng)、乳品廠及食品衛(wèi)生檢測(cè)部門的使用。

[1]鄧斌,鄧春來,張曦 .牛奶中抗生素殘留及其檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè),2003,24(4)：24-27.

[2]陳懷宇,黃周英,林育騰 .牛乳中抗生素的殘留與危害現(xiàn)狀[J].泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào),2004,22(6)：102-106.

[3]NEAL C E,CALBERT H E.The Application of the 2,3,5-TriphenylterfrAzolium Chloride Test for Inhibitory Substances in Milk[J].Dairy Science,1955,38：597.

[4]紀(jì)淑娟,浩淼,李東華 .TTC法檢測(cè)牛乳中抗生素快速檢測(cè)試紙的制作[J].食品工業(yè)科技,2009,9(2)：85322-327.

[5]P J THOMPSON,O A THAMES.Sporulation ofBacillus stearother m ophilus[J].Applied Microbiology,1967,15(5)：975-979.

[6]王天云,陳振風(fēng),王福源 .一種促使乳酸芽孢桿菌大量生成芽孢的方法[J].工業(yè)微生物,2001,31(3)：13-18.

[7]JACQUES N,HARRY V,IISE S,et al.A microbiological assay system for assess ment of raw milk exceeding EU maximum residue levels[J].IntDairy J,1999,9(2)：85-90.

[8]CODEX A.Residues of veterinary drugs in foods[S].Food and Agiculture Organization of the United Nations,FAO,Rome. 1993,3,Second Edition.

Preparation and application of kit for detection of antibiotic residue in milk

XIE L i1,CHENG Hua1,DONG Chao1,L I Zhi-ping2,ZHU Jun-ping3,YAN Jing-hui1,＊
(1.Hebei Institute ofBiology,Shijiazhuang 050081,China; 2.Hebei Institute ofVeterinaryMedision Superusion,Shijiazhuang 050051,China; 3.Hebei Sanyuan Food Co.,Ltd.,Shijiazhuang 050071,China)

In orde r to ques t for a kind of s imp le m e thod to check whe the rm ilk conta ins antib iotics in a concentra tion exceed ing the M ax im um Res idue L im its(MLR),thecond ition of thede tec tion such assp orula tion Bac illus S tea rothe rm op hillus and nutrient and add ing p rop ortion of each comp onent we re s tud ied.The es tab lished kit tha t each we ll of96p la te conta ined g row th m ed ium sp read w ith Bac illus s tea rothe rm op hilus sp ores,which assure to96 ind ividua l tes ts we re checked a t the sam e t im e.The de tec tion l im its of the kit to p enic illin,am oxic illin,cep hap irin we re3,4and8ng/mL,resp ec tive ly.Through de tec ting the sam e sp ec im en g roup(n=120),it was p roved tha t the es tab lished kit had no d iffe rence to the kit of ZEU- INMUNO TEC comp any in sens itivity and its sup e rior to TTC m e thod on sens itivity and convenience.As a result,it could be used to de tec t antib iotics in m ilk.

antib iotic res idue;de tec tion;m ilk;Bac illus S tea rothe rm op hillus

TS207.3

A

1002-0306(2010)02-0321-03

牛奶是老少皆宜的營養(yǎng)品,但是在奶牛的養(yǎng)殖過程中,為了治療和預(yù)防奶牛乳腺炎和其它細(xì)菌感染性疾病,一些養(yǎng)殖戶使用了青霉素等抗生素,進(jìn)而在牛乳中產(chǎn)生了抗生素殘留;更有一些不法奶農(nóng)為防止細(xì)菌的大量繁殖和牛奶的酸敗人為添加抗生素,原料奶中抗生素殘留會(huì)影響奶制品品質(zhì),長期食用會(huì)危害人體健康。因此,牛奶中抗生素殘留問題日益受到國際社會(huì)的重視,各國(均制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn),建立了多種檢測(cè)手段)也在通過各種檢測(cè)技術(shù)查處有抗奶,來保障人們飲用牛奶的衛(wèi)生和安全[1-2]。國外已有相關(guān)的抗生素檢測(cè)試劑盒上市,但價(jià)格昂貴。而國內(nèi)的商品化試劑盒較少,目前我國常采用的檢測(cè)方法為 TTC法,此方法結(jié)果可靠,檢測(cè)費(fèi)用較低,一般實(shí)驗(yàn)室都能操作。但因其檢測(cè)周期長、操作繁瑣、結(jié)果辨別不準(zhǔn)確等缺點(diǎn),影響了在實(shí)際中的應(yīng)用[3-4]。因此研制簡(jiǎn)單有效、價(jià)格低廉的檢測(cè)試劑盒有廣闊的市場(chǎng)前景。本實(shí)驗(yàn)室研究制作了嗜熱脂肪芽孢桿菌 96孔板試劑盒,可簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢測(cè)牛奶中的抗生素殘留。其原理是嗜熱脂肪芽孢桿菌對(duì)多種抗生素尤其是β-內(nèi)酰胺類抗生素具有高度敏感性,如果被檢樣品中含有抗生素殘留,這些物質(zhì)擴(kuò)散到基質(zhì)中,抑制了芽孢的萌發(fā)和繼續(xù)繁殖,阻斷糖類轉(zhuǎn)化形成有機(jī)酸,通過加入指示劑的顏色變化可進(jìn)行辨別。實(shí)驗(yàn)對(duì)于營養(yǎng)培養(yǎng)基成分、指示劑及芽孢添加量等條件進(jìn)行了探索,使檢測(cè)結(jié)果達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的靈敏度。

2009-08-24 ＊通訊聯(lián)系人

謝莉(1976-),女,工程師,主要從事食品安全方面的研究。