殼聚糖鑭配合物的制備、表征及其抑菌性能

馮小強(qiáng),李小芳,楊 聲,＊,伏國(guó)慶,王廷璞,蘇中興

(1.天水師范學(xué)院生化學(xué)院,甘肅天水 741001; 2.天水市中醫(yī)醫(yī)院,甘肅天水 741001;3.蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,甘肅蘭州 730000)

殼聚糖鑭配合物的制備、表征及其抑菌性能

馮小強(qiáng)1,李小芳1,楊 聲1,＊,伏國(guó)慶2,王廷璞1,蘇中興3

(1.天水師范學(xué)院生化學(xué)院,甘肅天水 741001; 2.天水市中醫(yī)醫(yī)院,甘肅天水 741001;3.蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,甘肅蘭州 730000)

合成了不同配比的殼聚糖鑭配合物,運(yùn)用 FT-I R、UV、TG-DTA和循環(huán)伏安法進(jìn)行了表征。測(cè)試了殼聚糖及其鑭配合物對(duì)埃希氏大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能。結(jié)果表明,殼聚糖鑭配合物的抑菌性能較殼聚糖有明顯提高,抑菌性能隨鑭與殼聚糖配比的增大而增強(qiáng)。殼聚糖鑭配合物處理后的 E.coli和 St.aureus的細(xì)胞壁、膜被損壞,外部有內(nèi)容物溢出,表明殼聚糖鑭配合物首先作用于細(xì)菌細(xì)胞壁膜,進(jìn)而進(jìn)入菌體內(nèi)部而起到抑菌作用。

殼聚糖,殼聚糖鑭配合物,制備,表征,抑菌性能

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 相對(duì)分子量 14萬(wàn),DD＞95%,浙江金殼生物化學(xué)有限公司;La2O3純度 99.95%,上?；瘜W(xué)試劑公司;硝酸、NH3·H2O、NaOH、無(wú)水乙醇、乙醚、醋酸 均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水 二次蒸餾水;大腸埃希氏菌 (E.coli,ATCC 35218),金黃色葡萄球菌(S t.aureus,ATCC 26113),牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,瓊脂培養(yǎng)基。

紫外可見分光光度計(jì) UV-9200型,北京瑞利分析儀器公司;TG-DT A分析儀 Pyris Diamond Analyzer;Spectrum One傅立葉紅外光譜儀 Perkin E lmere;LK98A微電極電化學(xué)分析系統(tǒng) 天津蘭力科,修飾玻碳電極為工作電極,飽和甘汞電極做參比電極(vs.SCE.),Pt柱為對(duì)電極;JEM-1230透射電子顯微鏡 Hitachi,Tokyo,Japan。

1.2 殼聚糖鑭配合物的制備

稱取0.5g CTS溶解于50mL 1%HAc溶液中。按殼聚糖 (糖單元)與 La(Ⅲ)摩爾比為 4∶1、2∶1、1∶1、0.5∶1、0.25∶1加入不同質(zhì)量的 La(NO3)3攪拌,編號(hào)1～5。用 1%的氨水調(diào)節(jié) pH至 5.0,室溫下攪拌反應(yīng)12h。將其混合液濃縮后冷卻至室溫,加入到 200mL丙酮溶液中沉淀。依次用蒸餾水、無(wú)水乙醇、乙醚洗滌,得到殼聚糖鑭配合物。

1.3 殼聚糖鑭配合物抑菌活性的測(cè)定

1.3.1 菌懸液的制備 受試菌種(標(biāo)準(zhǔn)菌株)接種于固體瓊脂培養(yǎng)基,37℃活化 24h。將活化后的受試菌種用接種環(huán)挑取菌苔于生理鹽水中,制成 OD610nm= 0.7的菌懸液備用。

1.3.2 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、固體瓊脂培養(yǎng)基的制備 參見文獻(xiàn)[11]。

1.3.3 樣品溶液的配制 殼聚糖及殼聚糖鑭配合物用 0.3%HCl溶解,分別配制 10mL 15mg/mL的樣品溶液。

1.3.4 抑菌性能測(cè)試 (OD) 受試菌種 (標(biāo)準(zhǔn)菌株)接種于固體瓊脂培養(yǎng)基,37℃活化 24h?；罨蟮氖茉嚲N用接種環(huán)挑取菌苔于生理鹽水中,制成OD630nm=0.7的菌懸液備用。將 13.9mL的液體培養(yǎng)基與1mL的藥物溶液混合,加入 100μL菌懸液,使殼聚糖及其配合物的最終濃度為 1mg/mL,恒溫振蕩培養(yǎng)。測(cè)定不同時(shí)間內(nèi)的 OD610nm值,光密度越小,抑菌性能越強(qiáng)。恒溫培養(yǎng) 48h后采用菌落平板記數(shù)法測(cè)定殼聚糖的最小抑菌濃度 (M I C),使殼聚糖的最終濃度分別 為 0.05%、0.025%、0.0125%、0.00625%、0.00313%、0.00156%(w/v)。最小抑菌濃度定義為與對(duì)照相比,以肉眼觀察不到菌落對(duì)應(yīng)的殼聚糖與其配合物的濃度[12]。

1.4 殼聚糖鑭配合物的表征

1.4.1 紅外光譜(FT-I R) 采用 KBr壓片法測(cè)定殼聚糖及其鑭配合物的紅外吸收光譜,測(cè)量波長(zhǎng)數(shù)為400～4000cm-1。

1.4.2 紫外光譜(UV) 以 0.3%HCl殼聚糖溶液為空白,于 200～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定殼聚糖與殼聚糖鑭配合物的紫外吸收光譜。

1.4.3 差熱-熱重分析 (TG-DTA) 以α-Al2O3為參比,升溫速率 10℃/min,對(duì)殼聚糖及殼聚糖鑭配合物進(jìn)行熱力學(xué)分析。

1.4.4 殼聚糖鑭配合物的循環(huán)伏安行為 玻碳電極用三氧化二鋁拋光粉拋光處理后,依次用 1∶1的硝酸溶液、無(wú)水乙醇、去離子水超聲 5min,將電極置于紅外燈下烘烤至干,待電極冷卻后,用微型注射器取10mg/mL的殼聚糖鑭配合物溶液 10μL,均勻涂在電極表面,自然晾干,便得到殼聚糖鑭配合物化學(xué)修飾電極,在 1mol/L的 KNO3緩沖液中測(cè)定其循環(huán)伏安行為。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

對(duì)比圖 1中 a和 b可看出,殼聚糖中在 I R譜圖高波數(shù)區(qū) 3436cm-1處-OH與-NH2的締合伸縮振動(dòng)吸收峰在配位后峰形變寬,說(shuō)明殼聚糖中的-NH2、-OH可能參與了配位反應(yīng)。殼聚糖在 1649cm-1處有較強(qiáng)的酰胺吸收峰,配位后位移至 1635cm-1處, 1711cm-1處為殼聚糖中酰胺鍵中的-C=O吸收峰,在配合物中消失,證明殼聚糖中的酰胺鍵參與了配位;殼聚糖中 1590cm-1左右的-NH2伸縮振動(dòng)吸收峰配位后消失,1383cm-1附近處出現(xiàn) C-H彎曲振動(dòng)和C-N的伸縮振動(dòng)疊加吸收在配合物中發(fā)生了微小位移并有所減弱,說(shuō)明氨基參與了配位;殼聚糖中位于1155cm-1處仲羥基的 C-O伸縮振動(dòng)吸收峰在配合物中消失,位于 1091.73cm-1處的伯羥基的 C-O伸縮振動(dòng)吸收峰移至 1089.12cm-1處且峰形變寬, 1421.21cm-1的-OH收縮峰在配合物中幾乎消失,表明-OH參與了配位[1]。以上結(jié)果說(shuō)明殼聚糖中的-OH與-NH2都參與了配位反應(yīng)。

圖 1 殼聚糖(a)及其鑭配合物(b)的紅外光譜

2.2 紫外光譜分析

由圖 2可知,殼聚糖在 257.00nm和 326.00nm處有 2個(gè)強(qiáng)吸收峰,且峰形較寬,而 CTS-La(Ⅲ)吸收在259.00nm和 331.50nm處,發(fā)生了較大的位移且吸收強(qiáng)度發(fā)生了變化,這可能是配合物中氮、氧的孤對(duì)電子發(fā)生 n→σ＊躍遷,導(dǎo)致電子光譜發(fā)生變化。由此可證明La(Ⅲ)與 CTS發(fā)生了配位反應(yīng),且 C-N鍵由于-NH2與La(Ⅲ)的結(jié)合,在一定程度上使該鍵有所削弱,從而可推斷-NH2是CTS分子中主要吸附部位。

圖2 殼聚糖及其鑭配合物的紫外光譜

2.3 差熱-熱重分析

由殼聚糖及殼聚糖 La(Ⅲ)配合物的 TG-DTA曲線(圖 3)可知,殼聚糖及殼聚糖 La(Ⅲ)配合物的失重都分為三個(gè)階段：第一階段,殼聚糖為20～150℃,殼聚糖La(Ⅲ)配合物為 20～180℃,在這一階段兩者分別失重 11.3%和 13.4%;第二階段,殼聚糖為 150～310℃,殼聚糖 La(Ⅲ)配合物為180～380℃,在這一階段殼聚糖和殼聚糖 La(Ⅲ)配合物分別失重 56.5%和 29.8%;第三階段,殼聚糖為310～630℃,殼聚糖 La(Ⅲ)配合物為 380～560℃,在這一階段殼聚糖和殼聚糖 La(Ⅲ)配合物分別失重28.8%和 32.0%。分析可知,殼聚糖 150℃以前和殼聚糖La(Ⅲ)配合物 180℃以前的失重都是由失水所致;殼聚糖 150～310℃和殼聚糖 La(Ⅲ)配合物在180～380℃出現(xiàn)的失重,是由于殼聚糖和殼聚糖La(Ⅲ)配合物的降解;第三階段的失重,可能是由于殼聚糖與鑭配位后,其分子內(nèi)的氫鍵結(jié)合被破壞,結(jié)晶度發(fā)生改變,熱穩(wěn)定性減小的原因。

圖 3 殼聚糖(a)及其鑭配合物(b)的差熱-熱重分析

2.4 殼聚糖鑭配合物修飾電極的循環(huán)伏安行為

圖 4為殼聚糖和殼聚糖鑭配合物修飾玻碳電極在 1mol/L KNO3緩沖液中掃速為 100mV/s時(shí)的循環(huán)伏安曲線?？梢钥闯?殼聚糖修飾電極在 KNO3緩沖液中無(wú)氧化-還原峰出現(xiàn),而殼聚糖鑭配合物修飾電極在約-0.245V處出現(xiàn)一還原峰,在 0.536V左右出現(xiàn)一氧化峰,說(shuō)明非電活性的殼聚糖與鑭離子發(fā)生了配位,生成了具有電活性的殼聚糖鑭配合物。

圖4 殼聚糖鑭配合物的循環(huán)伏安曲線注：a.CTS-La(Ⅲ)修飾玻碳電極; b.殼聚糖修飾玻碳電極 KNO3緩沖液中。

2.5 抑菌性能研究

圖 5為殼聚糖及其鑭配合物分別作用于 E.coli和 S t.aureus在不同時(shí)間的 OD610nm曲線圖。E.coli和S t.aureus經(jīng)殼聚糖和殼聚糖鑭配合物作用后,對(duì)應(yīng)的光密度值均小于殼聚糖,說(shuō)明殼聚糖在發(fā)生配位反應(yīng)以后抑菌性能有所增強(qiáng)。另外,隨著 La(Ⅲ)與殼聚糖配比的增加,其對(duì) E.coli和 S t.aureus的抑制作用逐漸增強(qiáng)。表 1為殼聚糖及其鑭配合物對(duì) E.coli和 S t.aureus的最小抑菌濃度,可以看出,隨著配合物中La(Ⅲ)濃度的增大,其抑菌性能增強(qiáng),最小抑菌濃度依次降低,說(shuō)明配合物的抑菌性能是殼聚糖與 La (Ⅲ)的協(xié)同作用。

圖 5 殼聚糖鑭配合物對(duì) E.coli(a)和 St.aureus(b)的抑菌性能

研究認(rèn)為[13],殼聚糖的抑菌作用與其氨基的質(zhì)子化有關(guān),在酸性條件下,殼聚糖分子鏈上的-NH2與 H+結(jié)合形成-NH+3正離子,與細(xì)菌表面的負(fù)電荷發(fā)生靜電作用,使細(xì)菌被絮凝,聚沉,生長(zhǎng)繁殖也隨之減弱。另外,在酸性環(huán)境下,質(zhì)子化氨中的 H+可能與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合,并能交換細(xì)胞表面的某些微生物生長(zhǎng)所需要的陽(yáng)離子如Mn2+、Ca2+、Mo2+等,從而影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的影響。CTS-La(Ⅲ)能顯示出較殼聚糖強(qiáng)的抑菌活性,是由于殼聚糖和La(Ⅲ)兩者抑菌活性的協(xié)同作用,殼聚糖與La(Ⅲ)配位后,所帶正電荷較殼聚糖增多,更易與細(xì)菌結(jié)合,故抑菌活性高于殼聚糖。

表 1 殼聚糖鑭配合物的最小抑菌濃度(%、w/v)

2.6 殼聚糖鑭配合物處理前后大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的形貌變化

大腸桿菌(圖6a、圖6b)：對(duì)照組(圖6a)：細(xì)菌切面多呈桿狀,細(xì)胞壁、細(xì)胞膜完整,胞質(zhì)均勻。藥物組(圖6b)：細(xì)菌形態(tài)呈現(xiàn)球形體,菌體細(xì)胞壁部分或全部脫落消失,細(xì)菌輪廓模糊,外觀呈毛刺狀,結(jié)構(gòu)不清且發(fā)生不同程度的凹陷變形,甚至穿孔和破碎;胞漿內(nèi)容物稀疏,空隙明顯擴(kuò)大,細(xì)胞外有溶出物出現(xiàn)。細(xì)菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)消失或分布異常。

圖 6 殼聚糖鑭配合物處理前(a、c)后 (b、d)E.coli和 St.aureus的形貌

金黃色葡萄球菌(圖 6c、圖 6d)：對(duì)照組(圖 6c)：細(xì)菌切面多呈葡萄球狀,細(xì)胞壁、細(xì)胞膜完整,胞質(zhì)均勻。藥物組(圖6d)：細(xì)菌形態(tài)發(fā)生變化,細(xì)菌內(nèi)部分布異常,菌體輪廓模糊,外圍有液體溢出的痕跡,并有空腔出現(xiàn)。

3 結(jié)論

3.1 合成了幾種不同配比的 CTS-La(Ⅲ)配合物。FT-I R、UV、TG-DT A、循環(huán)伏安分析結(jié)果表明,殼聚糖與La(Ⅲ)之間發(fā)生了配位反應(yīng),形成了配合物CTS-La(Ⅲ)。

3.2 配合物 CTS-La(Ⅲ)的抑菌性明顯強(qiáng)于殼聚糖,其抑菌性能與La(Ⅲ)與殼聚糖的摩爾配比有關(guān),隨著配合物中La(Ⅲ)含量的增加,最小抑菌濃度減小,抑菌性能逐漸增強(qiáng)。

3.3 CTS-La(Ⅲ)配合物處理后的 E.coli和 S t.aureus的細(xì)胞壁、膜被損壞,外部有內(nèi)容物溢出,表明 CTSLa(Ⅲ)首先作用于細(xì)菌細(xì)胞壁膜,進(jìn)而進(jìn)入內(nèi)部。

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Synthesis,characterization and antibacterial activity of chitosan-La(Ⅲ)complexes

FENG Xiao-qiang1,L I Xiao-fang1,YANG Sheng1,＊,FU Guo-qing2,WANG T ing-pu1,SU Zhong-xing3
(1.College ofBiology and Chemistry,TianshuiNormalUniverity,Tianshui 741001,China; 2.Tianshui Traditional ChineseMedical Hospital,Tianshui 741001,China; 3.Chemistry and Chemical Engineering College,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)

Chitosan-La(Ⅲ)comp lexes w ith d iffe rent ra tios we re synthes ized.The s truc tures of these comp lexes we re cha rac te rized by FT-IR,UV and TG-DTA.M oreove r,the antibac te ria l ac tivity of chitosan and its che lae comp lexes aga ins t E.coli and S t.aureus we re inves tiga ted in vitro.The results ind ica ted tha t the antibac te ria l ac tivity of chitosan che la te comp lexes was m a rked ly imp roved comp a red w ith chitosan,and which was re la ted to the ra tio of chitosan to La(Ⅲ).The ce ll wa ll and m em b rane of E.coli and S t.aureus we re des troyed afte r trea ted by chitosan-La(Ⅲ)comp lexes.

chitosan;chitosan-La(Ⅲ)comp lexes;synthes ize;cha rac te riza tion;antibac te ria l ac tivity

TS201.2

A

1002-0306(2010)02-0304-04

殼聚糖分子中含有羥基 (-OH)和游離的氨基(-NH2),其分子結(jié)構(gòu)中每個(gè)基本單元都連有一個(gè)伯氨基,氮原子上的孤對(duì)電子可投入到金屬離子等的空軌道中,形成配位鍵結(jié)合,因此它可以與 Fe2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+等配位,有效地捕集或吸附溶液中的金屬離子[1-4]。Wang等發(fā)現(xiàn)殼聚糖金屬離子配合物的抑菌活性優(yōu)于殼聚糖[5]。殼聚糖硒作為補(bǔ)硒劑,毒性較小,硒化殼聚糖對(duì)癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用[6]。目前,殼聚糖及其降解產(chǎn)物在抗菌、抑菌方面已被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域中,其中有關(guān)殼聚糖及其衍生物抗菌性能的報(bào)道較多[7-9],認(rèn)為殼聚糖不僅具有天然抗菌性能,而且抗菌譜廣。殼聚糖能有效地抑制細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)和繁殖,與一般抑制劑相比,它具有抑菌活性高、廣譜、殺滅率高等優(yōu)點(diǎn)[10]。稀土元素具有許多特殊的生物活性和較好的抗菌能力,將其與殼聚糖配位將有望提高殼聚糖的抑菌性能和生物活性。論文合成了幾種不同配比的殼聚糖鑭配合物,運(yùn)用 FT-I R、UV、TG-DTA和循環(huán)伏安法對(duì)配合物進(jìn)行了表征。測(cè)試了殼聚糖及其鑭配合物 (CTSLa(Ⅲ))對(duì)大腸埃希氏菌 (E.coli)和金黃色葡萄球菌(S t.aureus)的抑菌性能。結(jié)果表明,殼聚糖鑭配合物的抑菌性能較殼聚糖有所提高,抑菌性能與其配比有關(guān)。該研究將拓展殼聚糖作為抑菌材料的應(yīng)用前景,有望開發(fā)一種天然綠色稀土生物農(nóng)藥。

2009-03-17 ＊通訊聯(lián)系人

馮小強(qiáng)(1980-),男,講師,研究方向：天然高分子生物活性研究。

天水師范學(xué)院院立項(xiàng)目;物理無(wú)機(jī)化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目。