兩株酒曲毛霉的分離及BIOLOG微生物系統(tǒng)分析鑒定

廖永紅,任文雅,伍松陵,沈 晗

(1.北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100048; 2.國(guó)家糧食局科學(xué)研究院,北京 100037)

兩株酒曲毛霉的分離及BIOLOG微生物系統(tǒng)分析鑒定

廖永紅1,任文雅1,伍松陵2,沈 晗1

(1.北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100048; 2.國(guó)家糧食局科學(xué)研究院,北京 100037)

利用稀釋平板法從曲樣和酵泥單菌落中分離獲得 2株毛霉 1#和 2#,通過(guò)對(duì)其形態(tài)觀察和Biolog微生物系統(tǒng)鑒定,確定 2株菌分別為:1#菌為卷枝毛霉 (M ucor circinelloides v.Tiegh),2#菌為密叢毛霉 (M ucor plumbeus Bonord)。所得菌株進(jìn)行冷凍干燥保藏。不同菌種對(duì)Biolog 96孔碳源利用有顯著差異,同一菌種不同時(shí)間對(duì) Biolog 96孔碳源利用也有差異,分析得出 1#、2#毛霉主要利用 ɑ-酮戊二酸、L-谷氨酸。

毛霉,分離,Biolog微生物系統(tǒng)鑒定

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種分離用培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基[6-7]; Biolog鑒定用麥芽汁培養(yǎng)基 2%麥芽汁,2%瓊脂,冷卻后調(diào)整 pH至 5.5 ±0.2(28℃),121℃滅菌15min;曲粉,接種液。

濁度計(jì)、FF接種板、Biolog微生物儀 美國(guó)Biolog公司;130s型超凈工作臺(tái) 北京賽博伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛霉的分離與純化 毛霉的分離純化過(guò)程工藝流程如下:

無(wú)菌條件下,將曲搗碎,稱取適量樣品,選取適宜的稀釋度用生理鹽水稀釋,以涂布平板法分別涂于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基平板上,35℃培養(yǎng) 48h,檢查菌落出現(xiàn)情況。取單菌落,用接種針挖掘一小塊菌絲移植于另一平板培養(yǎng)基上,35℃培養(yǎng) 72h,再?gòu)拈L(zhǎng)有單菌落的平板中選取典型的毛霉菌落,取孢子體制成懸液,涂布培養(yǎng)、鏡檢,重復(fù)培養(yǎng) 2～3次以分離純化毛霉。將純化了的毛霉轉(zhuǎn)接到察氏斜面上培養(yǎng),待生長(zhǎng)完好后置于 4℃冰箱中保存。

1.2.2 Biolog微生物鑒定 按照 Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)[8],對(duì)從樣品中分離出的 1#、2#菌種作微生物鑒定,分析菌種利用 C源的情況。

1.2.2.1 樣品菌種活化 將察氏培養(yǎng)基冷卻后倒入小平板中(大約 10mL)。放置到 28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h,以確定平板沒(méi)有被污染。然后采取點(diǎn)植法將菌種點(diǎn)到察氏培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)。

挑取斜面上的菌,采用點(diǎn)植法,進(jìn)行培養(yǎng),時(shí)間是 48h,溫度是 28℃。

1.2.2.2 鑒定方法[9]濁度調(diào)整:關(guān)閉電源,調(diào)整指針至“0”刻度;用吸水紙擦干凈空白接種液管外壁,置于濁度計(jì)中,接通電源,用無(wú)菌水調(diào)整指針至100%T。菌懸液制備:取無(wú)菌棉簽在接種液中蘸濕,將棉簽在菌落表面轉(zhuǎn)動(dòng),粘取菌體,注意不要帶出培養(yǎng)基。傾斜接種液管并沿內(nèi)壁轉(zhuǎn)動(dòng)棉簽,使菌體附著在內(nèi)壁上,同時(shí)將菌體均勻打散。通過(guò)添加菌體或空白接種液調(diào)整濁度值,使其在相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)濁度值的 ±2%范圍內(nèi)。由于標(biāo)準(zhǔn)管中不是水,所以調(diào)整濁度的時(shí)候要十分小心。使用濁度標(biāo)準(zhǔn)管調(diào)整至標(biāo)準(zhǔn)濁度值 75%±2%。接種微平板:將已經(jīng)調(diào)整好濁度的菌液,用 100μL的移液槍仔細(xì)地接種到 Biolog鑒定板上,放置在裝離心管的長(zhǎng)盒中,并在盒的底部鋪上手紙,保持一定的濕度。微平板讀數(shù):FF微平板讀數(shù)時(shí)間分別為:0h,微平板培養(yǎng)后 24、48、72、96、120、144、168h。Biolog Microstation系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)檢索并讀取數(shù)據(jù),同時(shí)給出最匹配的 10個(gè) ID名稱。

1.2.3 菌種保藏 對(duì)所得菌種采用真空冷凍干燥法保藏[10]。將裝有菌懸液的安碚管直接放在低溫冰箱中(-80℃)或放在干冰無(wú)水乙醇浴中進(jìn)行預(yù)凍。然后置于真空干燥箱中,開動(dòng)真空泵進(jìn)行真空干燥,最后將安碚管封口置于冰箱 (5℃左右)中或室溫下避光保存。干燥后樣品呈白色疏松狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離與純化

樣品稀釋后在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基上培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)土豆培養(yǎng)基上主要是有酵母菌和霉菌,其中霉菌主要是毛霉、根霉、曲霉[11];麥芽汁培養(yǎng)基上有較多的酵母菌生長(zhǎng);在察氏培養(yǎng)基上主要是霉菌;從 4種培養(yǎng)基平板中共分離出霉菌 6株,對(duì)其中兩株毛霉進(jìn)行研究,依次編號(hào)為 1#、2#。

2.2 菌種的形態(tài)特征

毛霉繁殖迅速,菌落質(zhì)地疏松,菌絲體呈雪白色,細(xì)密,絨毛狀,無(wú)假根和匍匐枝,孢子囊梗直接由菌絲體生出,孢子圓形、淺褐色。

2.3 B io log微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)鑒定菌種

Biolog軟件將讀取的 96孔微平板反應(yīng)結(jié)果按照與數(shù)據(jù)庫(kù)的匹配程度列出 10個(gè)結(jié)果,每個(gè)結(jié)果均顯示 3種重要的參數(shù),即可知 Probability(PROB),相似性 S imilarity(S IM)和位距 Distance(D IS)。S IM和D IS是最重要的 2個(gè)參數(shù),S IM值表示測(cè)試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)相應(yīng)數(shù)據(jù)條的相似程度,D IS值表示測(cè)試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)相應(yīng)數(shù)據(jù)條的位距。Biolog系統(tǒng)規(guī)定:絲狀真菌培養(yǎng) 24h時(shí) S IM值≥0.9、培養(yǎng) 48h時(shí) S IM值≥0.70、培養(yǎng) 76h時(shí) S IM值≥0.65、培養(yǎng) 96h時(shí) S IM值≥0.60時(shí),系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)給出較為可靠的鑒定結(jié)果, S IM值越接近 1.00,鑒定結(jié)果的可靠性越高。

鑒定結(jié)果:按Biolog微生物鑒定標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì) 1#、2#菌進(jìn)行菌種鑒定,結(jié)果見表 1。

表 1 Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果

碳源分析:結(jié)果顯示 1#、2#屬于毛霉,同分離純化結(jié)果相同。考察各株菌在 0～168h對(duì) FF板上 C源的利用,其結(jié)果見圖 1和圖 2(圖 1和圖 2中的字母序號(hào)代表 FF版上不同碳源的位置)。

圖 1 1#菌種 C源利用情況

圖 2 2#菌種 C源利用情況

結(jié)果分析:在所有碳源中,選擇菌種利用最高的10種進(jìn)行分析。兩株菌雖然對(duì)α-酮戊二酸、D-木糖的利用率較高,但最高峰的數(shù)值卻不同。1#菌和 2#菌都可以利用α-酮戊二酸,且都在 48h時(shí)達(dá)到最大值,但 1#菌為 810,2#菌為 650。

1#菌對(duì)α-酮戊二酸、D-木糖的利用率最高,其它碳源的利用在 48h左右達(dá)到最高,此后一段時(shí)間基本保持穩(wěn)定。但在 120h時(shí)L-天門冬氨酸成為了利用最高的碳源。2#菌雖然對(duì) L-丙氨酸、D-木糖的利用率很高,但其它碳源的利用也隨著時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢(shì),利用比較平均。

168h時(shí),1#菌種和 2#菌種利用 L-丙氨酸、D-木糖、α-酮戊二酸為主要碳源。但 1#菌種對(duì)甘氨酰-L -谷氨酸、赤藻糖醇、α-甲基-D-葡萄糖苷利用率高于 2#菌種,而 2#菌種對(duì)N-乙酰-D-半乳糖胺的利用率高于 1#菌種。

天然 D-木糖是以多糖的形態(tài)存在于植物中。因?yàn)樗鼈兲貏e在農(nóng)產(chǎn)品的廢棄部分中 (例如玉米的穗軸、秸稈、棉桃的外皮)含量很多,所以用在生產(chǎn)上是經(jīng)濟(jì)廉價(jià)的原料。

由此得出,菌種對(duì)碳源的利用隨著生長(zhǎng)時(shí)間的變化而改變。各個(gè)菌種所利用的碳源種類不同,在同一時(shí)間下對(duì)相同碳源的利用率也有差別,菌種的來(lái)源以及不同生長(zhǎng)階段都會(huì)影響對(duì)碳源的利用。

3 結(jié)論

利用平板分離法從曲粉中分離出 2種菌,Biolog鑒定結(jié)果分別為:1#菌卷枝毛霉 (M ucor circinelloides v.Tiegh),2#菌密叢毛霉 (M ucor plum beus B onord)。

分析 1#、2#菌對(duì) Biolog96孔碳源利用情況,得出菌種對(duì)碳源的利用隨著生長(zhǎng)時(shí)間的變化而改變。各個(gè)菌種所利用的主要碳源雖然相同,但是對(duì)其他碳源的利用還是存在差異。例如 1#菌種還可以利用赤藻糖醇,2#菌種可以利用N-乙酰-D-半乳糖胺,同一時(shí)間下菌種對(duì)相同碳源的利用率不同,菌種的來(lái)源以及不同生長(zhǎng)階段都會(huì)影響對(duì)碳源的利用。

后續(xù)工作中需進(jìn)一步研究混合菌種的發(fā)酵特性、產(chǎn)香分析及感官評(píng)價(jià),為曲中優(yōu)勢(shì)微生物菌群的構(gòu)建以及進(jìn)一步優(yōu)化蛋白酶提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Samples of the two types of bacteria isolated and the biolog m icroorgan ism identification system

L I AO Yong-hong1,RENW en-ya1,W U Song-ling2,SHEN Han1
(1.College of Chemical and Environmental Engineering,Beijing Technology and BusinessUniversity,Beijing 100048,China; 2.Academy of Science Research of State Administration of Grain,Beijing 100037,China)

M ucor we re isola ted by s treak p la te m e thod,two M ucor s tra ins we re ob ta ined nam ed1#and2#, resp ec tive ly.B iolog autom a ted m ic robes identifica tion sys tem(B iolog Sys tem)was used to check twoM ucor s tra ins 1#and2#,which we re sep a ra ted and p urified from fe rm ented g ra ins of Chinese liquor.1#was identified as M ucor c irc ine lloides v.Tiegh and2#was identified as M ucor p lum beus Bonord.The results ind ica ted tha t B iolog Sys tem could be used to identify m ucor s tra ins in fe rm ented g ra ins.The las t,the s tra in through c ream e ry exp e r im ent was conse rved.D iffe rent s tra ins had d iffe rent result,1#,2#M ucorm a in useɑ-ke tog luta ric ac id,L-g lutam ic ac id.

M ucor;isola tion;B iolog m ic rob ia l identifica tion sys tem

TS201.3

A

1002-0306(2010)01-0191-03

酒曲中有豐富的微生物[1],釀造酒的獨(dú)特風(fēng)味及其質(zhì)量與酒曲中的微生物密切相關(guān)。民間傳統(tǒng)酒曲中主要分離得到的微生物有酵母菌、霉菌和細(xì)菌。其中霉菌中的毛霉具有較強(qiáng)的蛋白酶活性[2-3],采用不同的毛霉制曲,產(chǎn)物的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)也不同,因此對(duì)酒曲中的霉菌進(jìn)行種屬鑒定對(duì)酒的生產(chǎn)和發(fā)酵工藝的改良有重要的指導(dǎo)意義。Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)是美國(guó)Biolog公司從 1989年開始推出的一套微生物鑒定系統(tǒng)[4-5],可以鑒定包括細(xì)菌、酵母、絲狀真菌在內(nèi)的近 2000種微生物。Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)能利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化程度高,鑒定范圍大、速度快,目前已成為微生物分類鑒定常用的技術(shù)手段。本實(shí)驗(yàn)將酒曲中的毛霉進(jìn)行分離培養(yǎng),然后利用 Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行分類學(xué)鑒定,初步探討B(tài)iolog鑒定系統(tǒng)在酒曲毛霉菌鑒定中的應(yīng)用,為曲中的微生物分析奠定了基礎(chǔ)。

2009-06-30

廖永紅 (1965-),女,副教授,主要從事有關(guān)發(fā)酵工程及應(yīng)用微生物技術(shù)方面的教學(xué)和科研工作。

科技部工業(yè)微生物菌種資源標(biāo)準(zhǔn)化整理、整合及共享試點(diǎn)項(xiàng)目(2005DKA21204-07)。