陰離子交換樹脂固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的研究

馬玉紅,翁桂華,張 濤,江 波

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

陰離子交換樹脂固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的研究

馬玉紅,翁桂華,張 濤,江 波＊

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

從 13種離子交換樹脂和吸附樹脂中,篩選出固定化效果較好的大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂D380為載體,以戊二醛為交聯(lián)劑,通過先吸附后交聯(lián)的方法對果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化進(jìn)行分析,并對固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,最佳固定化條件為：加酶量為 200U/g樹脂,吸附 pH為 6.0,吸附時間為 6h,吸附溫度為 30℃,交聯(lián)劑戊二醛濃度為 0.01%,交聯(lián)時間為 6h,交聯(lián)溫度為 4℃,固定化酶活回收率最高可達(dá) 87.6%以上。

果糖轉(zhuǎn)移酶,固定化,樹脂

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉AS0023 為江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;樹脂 D202-Ⅱ309 213 313蘇青集團(tuán);X-5 DA201-B H-103 D301-Ⅲ 南開大學(xué)化工廠;D151 D152 D380 天津波鴻建材;5%戊二醛水溶液 中國醫(yī)藥 (集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司。

Centrifuge 5084R冷凍離心機(jī),SCIENTZ-2D超聲波細(xì)胞破碎儀,Waters 209高效液相色譜儀,SHA-2冷凍恒溫水浴振蕩器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樹脂的預(yù)處理 吸附樹脂采用乙醇、丙酮、蒸餾水交替處理,最后用蒸餾水沖洗至中性備用;離子交換樹脂先用蒸餾水浸泡脹潤、去雜,然后用 4% HCl、4%NaOH交替處理,最后用蒸餾水沖洗至中性,置于 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 游離果糖轉(zhuǎn)移酶提取方法 黑曲霉 AS0023細(xì)胞的制備見參考文獻(xiàn)[12]。稱取一定量黑曲霉細(xì)胞放入燒杯中,加入適量的 0.05mol/L、pH5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液,在冰浴環(huán)境中用超聲波細(xì)胞破碎儀處理一定時間后,于 4℃下冷凍離心 (10000×g) 20min,收集上清液在 4℃條件下進(jìn)行超濾以提高單位酶活,壓力 0.15MPa,截留相對分子質(zhì)量 10000,粗酶提取液放入冰箱保藏備用。

1.2.3 果糖轉(zhuǎn)移酶的固定化方法 用濾紙吸干濕樹脂表面的水后稱取 0.5g于三角瓶中,加入一定量的酶液,在所需的 pH下在恒溫水浴振蕩器中緩慢振蕩吸附一定時間后,加入一定量的戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)完成后,棄去上清,用緩沖溶液沖洗戊二醛殘留及未固定上的游離酶,所得固定化酶用緩沖液浸泡待用。

1.2.4 酶活測定方法 游離果糖基轉(zhuǎn)移酶活測定：一定體積底物濃度為10%(w/v)0.05mol/L、pH5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液于直徑 50mm、100mL的恒溫夾套酶反應(yīng)器中,50℃下恒溫?cái)嚢璺磻?yīng) 1h,于沸水中煮沸 10min終止反應(yīng)。

1.2.5 糖組分測定方法 采用 HPLC(高效液相色譜)法[12]。HPLC,Waters 209系列,配有 R401示差折光檢測器和 M740數(shù)據(jù)處理器;色譜柱：Hewlett Packard公司 APS Hypersil 4.6×100mm填料密度5μm;流動相：乙睛/水 75/25,流速 1mL/min;溫度28℃;進(jìn)樣量：10μL。

1.2.6 酶活力定義 每分鐘產(chǎn)生 1μmol蔗果三糖(1-kestose)為一個酶活力單位。酶用量為 2U/g蔗糖。固定化酶活測定方法同游離果糖基轉(zhuǎn)移酶活的測定方法。固定化酶活回收率：酶活回收率定義為固定化酶活與所添加的總酶活的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂載體的選擇

不同樹脂對果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化效果如表 1所示。

由表 1可知,不同樹脂的固定化效果差別明顯,其中D380和D296R固定化酶活力和酶活回收率均表現(xiàn)突出。另外,表中還有幾種陽離子交換樹脂未列出,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)陽離子樹脂基本不能固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶,這可能是因?yàn)槭褂藐栯x子交換樹脂時,為使酶蛋白帶正電荷,就要使固定化 pH低于該酶等電點(diǎn),而過低的 pH不利于酶活性的發(fā)揮從而使酶失活。D380為大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂,其功能基團(tuán)為伯氨基,因其具有弱堿性陰離子交換樹脂較高的離子交換容量和容易再生等特點(diǎn),已較成功地固定了木聚糖酶、α-淀粉酶等,故選擇 D380樹脂作為本實(shí)驗(yàn)的固定化載體。

2.2 固定化條件的優(yōu)化

2.2.1 加酶量對固定化效果的影響 固定其它條件,選擇不同的加酶量進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖 1所示。

圖1 加酶量對固定化效果的影響

由圖 1可以看出,隨著加酶量的增大,固定化酶活逐漸增大,但酶活回收率逐漸降低,而當(dāng)加酶量大于 400U/g載體時,固定化酶活的增加也變緩慢,這是因?yàn)樵陔x子交換樹脂的活性基團(tuán)未被酶交聯(lián)飽和前,固定化酶活將隨著加酶量的增加而增加;在活性基團(tuán)被酶交聯(lián)飽和后,固定化酶的活力不在隨加酶量的增加而明顯增加,甚至當(dāng)加酶量達(dá)到一定程度時,會因?yàn)榻Y(jié)合的酶分子過多而造成酶作用的空間位阻加大,使酶活性增加緩慢,甚至出現(xiàn)下降。因此,綜合考慮固定化酶活和酶活回收率,最適加酶量選擇 200U/g。

2.2.2 吸附 pH對固定化效果的影響 固定其它條件,改變酶液 pH進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖 2所示。

圖2 吸附pH對固定化效果的影響

由圖 2可以看出,在pH3～6時,隨著pH的增大,固定化酶活和酶活回收率都明顯增大,當(dāng) pH大于 6以后,固定化酶活和酶活回收率都開始下降,這可能是與本實(shí)驗(yàn)所用果糖基轉(zhuǎn)移酶的 pH穩(wěn)定性有關(guān),過高、過低的極端 pH會對酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響,致使固定化酶活降低,因此,最適的吸附 pH為 6.0。

2.2.3 吸附時間對固定化效果的影響 固定其它條件,選擇不同吸附時間進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖 3所示。

由圖 3可以看出,隨著吸附時間的延長,固定化酶活和酶活回收率均增大,但是在 6h后增加緩慢,這是因?yàn)殡S著時間的延長,陰離子樹脂表面的可交換基團(tuán)與酶蛋白的交換已逐漸達(dá)到平衡,而在平衡后再繼續(xù)增加吸附時間,樹脂上的可交換基團(tuán)基本沒有了,所以變換緩慢,從經(jīng)濟(jì)角度考慮,選擇 6h,既可以達(dá)到較好的固定化效果又可以縮短固定化時間。

表1 不同樹脂的固定化效果比較

圖3 吸附時間對固定化效果的影響

2.2.4 吸附溫度對固定化效果的影響 固定其它條件,選擇不同吸附溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖 4所示。

圖4 吸附溫度對固定化效果的影響

由圖 4可以看出,在較低溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高,固定化酶活和回收率都逐漸增加,當(dāng)溫度超過 30℃后,固定化酶活迅速下降,這可能是因?yàn)闇囟冗^高會使戊二醛對酶的變性作用增大,同時溫度過高也不利于酶的穩(wěn)定性,溫度較高時,酶容易失活;另一方面,蛋白質(zhì)的吸附是吸熱過程,在溫度較低時,酶也不容易吸附到樹脂上。因此固定化溫度以30℃左右為宜。

2.2.5 戊二醛量對固定化效果的影響 固定其它條件,選擇不同戊二醛量進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖 5所示。

圖5 戊二醛量對固定化效果的影響

由圖 5可以看出,在較低戊二醛濃度時,固定酶活逐漸增大,當(dāng)戊二醛濃度繼續(xù)增大時,固定化酶活和酶活回收率都隨戊二醛濃度的增加而降低。在交聯(lián)過程中,戊二醛既是固定化反應(yīng)的交聯(lián)劑,同時又是酶反應(yīng)的變性劑,當(dāng)戊二醛加入量不夠時,交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行不徹底,酶固定化不牢固;而交聯(lián)劑加入過多時,過度的分子內(nèi)交聯(lián)反應(yīng)會影響酶活性中心與底物的結(jié)合,從而降低了酶活,所以戊二醛濃度以0.01%(v/v)為宜。

2.2.6 交聯(lián)時間對固定化效果的影響 固定其它條件,選擇不同交聯(lián)時間進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖 6所示。

圖6 交聯(lián)時間對固定化效果的影響

由圖 6可以看出,隨著交聯(lián)反應(yīng)時間的延長,酶活力逐漸增加,在此階段主要發(fā)生的是酶分子間交聯(lián)反應(yīng),但超過 6h以后,酶活力增加緩慢,這是因?yàn)榉肿娱g交聯(lián)反應(yīng)達(dá)飽和后,開始發(fā)生酶分子內(nèi)交聯(lián),增加了酶分子間的空間位阻,直接影響到酶活性中心對底物的定位作用,且內(nèi)擴(kuò)散阻力也增大,而且戊二醛可發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的醛基數(shù)目有限,再增加交聯(lián)時間對固定化效果的提高也很有限,所以交聯(lián)時間以6h為宜。

2.2.7 交聯(lián)溫度對固定化效果的影響 固定其它條件,選擇不同交聯(lián)溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖 7所示。

圖7 交聯(lián)溫度對固定化效果的影響

由圖 7可以看出,在 0～4℃時固定化酶活和回收率逐漸增大,隨著溫度的逐漸升高固定化酶活反而降低,這可能主要是由于戊二醛的交聯(lián)性質(zhì)與其所在的 pH環(huán)境有關(guān),溫度偏高或者偏低都會改變戊二醛的 pH環(huán)境,從而使其降低甚至喪失交聯(lián)反應(yīng)的功能,因此交聯(lián)溫度以 4℃為宜。

3 結(jié)論

篩選出大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂D380為載體,通過先吸附后交聯(lián)的方法對果糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行固定化,優(yōu)化的固定化條件為：加酶量為200U/g樹脂,在 30℃、pH6.0的條件下吸附反應(yīng) 6h,加 0.01%(v/v)的交聯(lián)劑戊二醛在 4℃交聯(lián) 6h,獲得的固定化酶酶活回收率可達(dá) 87.6%。

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Study on the immobilization of fructosyltransferase by anion-exchange resin

MA Yu-hong,W ENG Gui-hua,ZHANG Tao,JIANG Bo＊
(State KeyLaboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Fruc tosyltransfe rase was imm ob ilized on13kinds of ion-exchange and adsorp tion res ins,am ong them D380showed the exce llent result for imm ob iliza tion.Then the enzym e was imm ob ilized through c ross-linkage of g luta ra ldehyde.The op t im um cond itions for the imm ob iliza tion we re as follows：200U of enzym e p e r g we t res in,pH 6.0,30℃,and6h,resp ec tive ly.The c ross linking temp e ra ture and t im e we re4℃ and6h resp ec tive ly,and the concentra tion of the c ross linking agent(g luta ra ldehyde)was0.01%.The ac tivity yie ld of imm ob ilized enzym e was above87.6%.

fruc tosyltransfe rase; imm ob iliza tion;res in

TS201.1

A

1002-0306(2010)02-0174-04

低聚果糖 (Fructooligosaccharides,簡稱 FOS),又稱寡果糖或蔗果三糖族低聚糖,分子式為：G-F-Fn, n=1～3(G為葡萄糖,F為果糖)。它是由蔗糖和 1～3個果糖基通過β-2-1糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。它是利用微生物或植物中具有果糖基轉(zhuǎn)移活性的酶作用于蔗糖而得的,反應(yīng)過程可以用以下反應(yīng)式表示[1]：

由于 FOS具有優(yōu)異的生理學(xué)功能而普遍地被用作保健食品配料[2],其在自然界廣泛存在于牛蒡、洋蔥、大蒜、香蕉等許多天然植物中[3],但含量很低。商品化的 FOS首先被 Hidaka H[4]用酶法開發(fā)成功,他從研究黑曲霉的果糖基轉(zhuǎn)移酶開始,然后成功地應(yīng)用于 FOS的工業(yè)化生產(chǎn)[5]。目前國內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)FOS的技術(shù)多為液體深層發(fā)酵法,但該法的缺點(diǎn)是產(chǎn)酶菌絲體只能利用一次,在 FOS生產(chǎn)過程中,由于菌絲體及其培養(yǎng)基成分的存在并參與反應(yīng),使整個工藝繁雜,成本高[6]。而酶的固定化技術(shù)為提高酶的使用效率、降低生產(chǎn)成本提供了可能性。因此,近年來果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化也逐漸成為研究的熱點(diǎn),已報(bào)道的有以多孔硅石、DEAE-纖維素、多孔離子交換劑、殼聚糖凝膠、大孔陰離子交換樹脂 201等為載體的固定化方法[7-11]。實(shí)驗(yàn)以大孔苯乙烯系陰離子交換樹脂D380為載體,采用先吸附后交聯(lián)的方法對黑曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行固定化,并對其固定化條件進(jìn)行了探討,為固定化酶在低聚果糖的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

2009-03-30 ＊通訊聯(lián)系人

馬玉紅(1982-),女,碩士研究生,研究方向：食品生物技術(shù)。

重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-200804)。