用復(fù)性電泳技術(shù)研究金線魚消化道蛋白酶的分布

朱美娟,陶 紅

(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品系,廣東廣州 510300; 2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510641)

用復(fù)性電泳技術(shù)研究金線魚消化道蛋白酶的分布

朱美娟1,陶 紅2

(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品系,廣東廣州 510300; 2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510641)

采用復(fù)性電泳和活力檢測方法對 3組不同體重的金線魚 (Nem ipterus virgatus)消化道蛋白酶的分布的研究表明：金線魚各消化器官蛋白酶活性均隨實驗魚體重增加而上升,但與體重增加不成比例。不同體重的金線魚的消化道蛋白酶不僅存在活力差異,在種類和數(shù)量上也存在明顯差別。3組魚的消化道蛋白酶單位酶活力從高到低依次為幽門盲囊 ＞胃 ＞前腸 ＞中腸 ＞后腸 ＞肝胰臟,但以總活力計算時,仍以胃部蛋白酶的總活力最大。

金線魚,復(fù)性電泳,消化道蛋白酶

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金線魚 (N em ipterus virgatus) 由華南理工大學(xué)綜合市場購得,為海捕冰鮮樣品。金線魚共分四組,第一、二和三組分別選擇平均體重為 154.36± 12.18g,250.72±20.63g和 329.09±23.95g的魚作為研究蛋白酶活力分布的研究原料,第四組選擇平均體重為 188.41±10.14g的金線魚作為消化道蛋白酶總活力在不同 pH下的分布研究的原料,每組選擇體重、規(guī)格相近的 12條魚為一組。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液的制備 將魚體解剖,取出整個消化系統(tǒng)。將整個消化系統(tǒng)分為胃、幽門盲囊、前腸、中腸、后腸五部分,去除其內(nèi)容物,用預(yù)冷去離子水沖洗干凈,剪碎。按樣品重的 5倍加入預(yù)冷去離子水,在高速組織勻漿機中冰浴勻漿,勻漿液置于 4℃冰箱中提取 12h后,以 10000r/min的速率離心 30min,收集上清液,進行酶活力檢測,24h內(nèi)檢測酶活力。全部操作除特別說明外,均在 4℃下進行。

1.2.2 消化道蛋白酶總活力在不同 pH下的分布參照 García-carreňo和 Haard(1993)的方法,并稍做修改[12]。用全消化道提取粗酶液。采用 0.1mol/L pH系統(tǒng)：pH2.0～3.0,采用 0.1mol/L Gly-HCl緩沖系統(tǒng);pH3.0～8.0,采用Mcilvaine’s緩沖液 (0.1mol/L檸檬酸鈉-磷酸鈉),pH9.0～11.0,采用 0.1mol/L Gly-NaOH緩沖系統(tǒng)。分別在各pH下測定蛋白酶相對活力。以最高酶活力為 100%計算。

1.2.3 不同體重金線魚消化道內(nèi)各部位蛋白酶活力分布的比較 對不同體重的 I、II、III組 (n=12每組)金線魚的各部位蛋白酶活力進行比較。胃部蛋白酶的活力測定采用 pH3緩沖系統(tǒng),其余各部位皆采用pH9緩沖系統(tǒng)。

1.2.4 不同部位蛋白酶譜的檢測 參照徐存拴和Díaz等復(fù)性電泳方法并修改分析[6-7]。采用 10%分離膠和 5%濃縮膠。本方法在制備聚丙烯酞胺凝膠時,將易被蛋白水解酶降解的明膠 (用作蛋白水解酶底物)共聚于分離膠里,電泳結(jié)束后,將與蛋白水解酶結(jié)合的 SDS用非離子去垢劑 (如 Triton X-100)除去,凝膠板里的蛋白水解酶即可恢復(fù)活性。在孵育期間,凝膠板所含的蛋白水解酶可將相應(yīng)位置的明膠消化掉,膠板經(jīng)固定后用 Coomassie Brillant 8250染色,整個膠板被染成藍色,但被蛋白水解酶消化掉明膠的區(qū)域不再為 Coomassie Brillant R250著色而成為無色透亮區(qū)域,該區(qū)域即為相應(yīng)蛋白水解酶的電泳位移。區(qū)域的大小和透光度代表該酶活性的強弱。

采用 10%分離膠、5%濃縮膠,樣品在加樣前加入1/3樣品緩沖液 (78%甘油 10mL+3.5mL 0.5mol/L, pH6.8的 Tris-HCl+10g SDS+86.5mL雙蒸水),每種樣品加 2槽,每槽加樣 100μg蛋白質(zhì) (唯腸道樣品加樣 10μg),電泳時電流不超過 10mA/板,4℃下電泳。電泳后用洗滌液 (3.03g Tris-base,12mL Triton X-100,500mL雙蒸水、pH6.5)洗滌膠板 30min,用雙蒸水洗 15min、膠板保溫液 (0. lmol/L Gly,5mmol/L CaCl2分別調(diào)所需 pH)洗滌 5min后,放入保溫液中置 37℃溫箱中保溫 24h。取出膠板放入固定液 (甲醇∶乙酸∶雙蒸水 =5∶1∶4)中 30min,接著,放入染色液(含 0.1%Coomassie Brillant R250的染色液)里微振蕩30min,然后放入脫色液(甲醇∶乙酸∶雙蒸水 =3∶1∶6)至酶活性區(qū)域清晰透亮 (使用用過多次的舊脫色液脫色,效果更佳)。

1.2.5 蛋白酶活力測定 蛋白酶活力以 1g鮮活組織中所含酶每分鐘水解酪素產(chǎn)生 1μg酪氨酸為一個酶活力單位,以μ/g·min表示。

蛋白酶的測定：參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) QB/T1803-93[8]。以酪蛋白為底物,胃蛋白酶的緩沖液改為 0.05mol/L pH2.5檸檬酸緩沖液;肝、腸、盲囊蛋白酶的緩沖液為0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl緩沖液,反應(yīng)溫度為 37℃,反應(yīng)時間為 10min,于 722分光光度計檢測波長680nm處的光吸收值。

本實驗中蛋白酶的活性單位則為每克消化道組織(濕重)的酶活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 金線魚消化道的蛋白酶總活力與 pH的分布

圖 1顯示了金線魚全消化道的蛋白酶總活力和不同 pH下的分布。從圖 1可以看出,蛋白酶在pH2～4和 pH9～10條件下出現(xiàn)了兩個相對高的活力峰。表明在消化道中不僅存在酸性蛋白酶,還存在堿性蛋白酶;而且在本實驗中堿性蛋白酶 (相對酶活為 100%)的活力要明顯高于酸性蛋白酶的活力 (相對酶活為 62%)(P＜0.05)。說明在金線魚的消化道中以堿性蛋白酶的活力占主體地位。對于魚類全消化道蛋白酶的活力在不同 pH下的分布,魚的種類不同,所得的結(jié)果不盡相同。在沙丁魚 (Sardinops m elanostica)[9]、鱭魚 (Engraulis encrasicholus)[10]、Scleropages for mosus(Osteoglossidae)[11]也都在 pH8～10的條件下出現(xiàn)了高的蛋白酶活力。但 Hidalgo對虹鱒魚 (Oncorhynchus m ykiss)、烏頰魚 (Sparus aurata)、金魚 (Carassiusauratus)、歐 洲鰻 魚 (Anguilla anguilla)、鯉魚 (Cyprinus carpio)和丁歲魚 (Tinca tinca)的全消化道蛋白酶活力在 pH下的分布進行了比較,虹鱒魚和鯉魚最高的蛋白酶活力出現(xiàn)在堿性條件下,而鰻魚的最高酶活力則出現(xiàn)在酸性范圍內(nèi)[12]。Yasuo(1969)對酸、堿性蛋白酶的最適 pH做了研究,測定了幾種魚類的酸性蛋白酶和堿性蛋白酶活性,發(fā)現(xiàn)酸性蛋白酶的最適 pH為 2.6～3.4,堿性蛋白酶的最適 pH為 8.0～8.5。

圖 1 金線魚消化道的蛋白酶總酶活和pH分布

不同種的魚其消化道的構(gòu)造不同,有胃魚類胃中作用最強的消化酶是胃蛋白酶,胃蛋白酶在較強的酸性范圍內(nèi)有較高的酶活力,其起作用的最適 pH在 2～3之間[11]。肝胰臟、腸道的蛋白酶種類較多,主要有糜蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶。關(guān)于腸道蛋白酶最適 pH報道較多,但都在 6.5～9.5之間,且多為微堿性。黃耀桐等 (1988)認(rèn)為,有胃魚類和無胃魚類腸蛋白酶最適 pH是不同的,不同食性最適 pH也有一定差異,但大都在 7.0～9.0之間,皆在中性和弱堿性范圍[13]。所以,從金線魚的蛋白酶分布可以看出,金線魚消化道存在酸性蛋白酶和堿性蛋白酶。

表 1 各消化器官蛋白酶活性(μ/g·min)

2.2 金線魚消化道蛋白酶的分布

對 3組不同體重的金線魚的 6個消化部位的蛋白酶活性的測定結(jié)果見表 1。

從表 1的測定結(jié)果分析表明,在相同的組別、不同的消化部位中,單位酶活力從高到低依次為幽門盲囊 ＞胃 ＞前腸 ＞中腸 ＞后腸 ＞肝胰臟,其中最適作用條件下幽門盲囊部位單位的酶活力顯著高于其它消化部位的單位酶活力,其次是前腸,而中腸對蛋白質(zhì)的消化能力顯著低于前三個部位,后腸和肝胰臟則幾乎不參加蛋白質(zhì)的消化。由于肝胰臟的蛋白酶主要來自腸道并以無活力的酶原形式存在,因而酶活力最低。而以總酶活來看,由于胃部的重量顯著高于前腸和幽門盲囊,所以仍以胃部的蛋白酶總活力最高。

對于同一消化部位,各消化器官蛋白酶活性均隨實驗魚體重增加而上升,但與體重增加不成比例。不同的部位增長的速度不同,肝臟中蛋白酶活力增長最快,其三組蛋白酶活力比值為 1∶1.97∶2.49;腸道中以前腸蛋白酶活力增長較多。金線魚消化道蛋白酶活力隨體重變化的另外一個特點是：金線魚體重從Ⅰ組變化到Ⅱ組,各部位蛋白酶活力增加明顯,而從Ⅱ組到Ⅲ組,蛋白酶增加的速度明顯減緩。不同體重各組實驗魚蛋白酶活性比值(Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ)在前、中、后各腸各段的比值分別為：1∶1.61∶1.86、1∶1.16∶1.52、1∶1.06∶1.52;在胃、肝胰臟、盲囊、全腸中的比值為：1∶1.23∶1.31、1∶1.97∶2.49、1∶1.29∶1.66、1∶1.28∶1.66。

研究表明,在魚類的生長發(fā)育過程中,蛋白酶的活性將隨著生長表現(xiàn)出總體上升的趨勢,但對于不同品種的魚類以及在不同消化器官中,蛋白酶活性的變化仍具有各自的特點[14-16]。Kuz’mina等 (1996)發(fā)現(xiàn)白斑狗魚、河鱸、歐鳊和擬鯉的蛋白酶活力在生長初期有一個急劇上升的變化,而后增長速度變慢[14];白東清等 (1999)報道,鯉前腸蛋白酶活性在體重 25～42g時迅速上升,在 42～199g時下降,在 199～464g時又緩慢上升[15]。本研究發(fā)現(xiàn)金線魚各消化器官蛋白酶活性均隨體重增加而上升,肝胰臟、胃和前腸蛋白酶活性在體重 154～250g的生長階段隨體重急劇上升,生長后期 250～329g上升幅度較小,與倪壽文等對草魚、鯉、鰱、鳙、尼羅羅非魚的研究結(jié)果相近[16]。Kuz’mina等(1996)認(rèn)為,魚類不同生長階段酶活力變化似乎與相對生長潛力(速度)存在某種對應(yīng)[14]。

腸道中各種蛋白酶的作用部位多集中于前、中腸段,到后段腸道酶活性開始遞減[17-18]。在本研究中,不同體重的金線魚腸道蛋白酶活性分布均表現(xiàn)出相似規(guī)律：即前腸 ＞中腸 ＞后腸,但不同體重的實驗魚蛋白酶活性在腸道各段的哀減規(guī)律并不相同：體重低于 250g的實驗魚,后腸蛋白酶活性衰減較多;當(dāng)體重高于 250g,中、后腸蛋白酶活性衰減明顯減慢。根據(jù)不同體重的金線魚腸道各段蛋白酶的分布規(guī)律推斷,體重 154～250g的金線魚,對蛋白質(zhì)消化能力的提高可能主要源于蛋白酶分泌量的提高,而對于體重 250～329g的實驗魚,由于消化酶分泌量的提高并不十分顯著,消化能力的提高可能主要源于腸道蛋白酶代謝失活速度減慢,有效作用時間延長。通過比較不同體重金線魚腸道蛋白酶活性變化也能夠發(fā)現(xiàn),隨體重增加,腸道各部位中以中、后腸道酶活性增加較多,表明隨著金線魚生長,中、后腸也在消化過程中逐漸起著越來越重要的作用。

魚類的食性不同、攝食能力不同,消化道的構(gòu)造差異較大,消化道的不同部位消化酶活性也有明顯差異。吳婷婷等認(rèn)為鰓魚、鰱魚蛋白酶活性由前腸向后腸逐漸降低,鱖魚胃蛋白酶的活性比腸道高得多,鰱魚前腸蛋白酶活性比后腸高,但差異不明顯。青魚、鯉魚、草魚和鯽魚蛋白酶活性由前腸向后腸逐漸升高,其中青魚前后腸蛋白酶活性差異顯著,草魚和鯽魚前后腸之間蛋白酶差異不明顯[19]。Hofer在墨桑比克羅非魚[20],Vys在尖齒鰱[31],倪壽文在草魚、鯉魚、鰱魚、鳙魚、尼羅羅非魚研究中都指出,腸蛋白酶活性由前腸向后腸逐漸降低[16]。周景祥研究得出鯉魚、大眼鰤鱸蛋白酶的活性從前腸向后腸逐漸下降,黃轂魚腸道蛋白酶活性中腸最高,后腸最低[17]。

2.3 金線魚消化道蛋白酶分布的復(fù)性電泳

金線魚消化道蛋白酶的分布規(guī)律從復(fù)性電泳的酶譜分布和亮帶寬度得以證實。復(fù)性電泳結(jié)果見圖2a和圖 2b。

從圖 2a酶譜上可以看出,對于胃蛋白酶(1～6泳道),I組的胃蛋白酶酶譜(圖 2a中 1～2泳道)只有一條譜帶,而 II和 III組胃蛋白酶酶譜(圖 2a中 3～6泳道)卻有三條譜帶,說明在平均體重 154g的金線魚胃中只有一種分子量大小的蛋白酶,而在平均體重為 250g和 329g的金線魚胃中,卻有兩種分子量大小的蛋白酶,蛋白酶的種類和數(shù)量明顯增多,這可能是引起蛋白酶急劇升高的主要原因;另一方面,從酶譜圖亮帶的寬度上,III組譜帶的亮帶區(qū)域明顯寬于 II組,說明 III組胃蛋白酶的種類數(shù)量與 II組相同,但活力明顯高于 II組。有報告證實,動物和人體內(nèi)存在多種胃蛋白酶,人胃粘膜能分泌多種胃蛋白酶原, Samloff根據(jù)它們不同的電泳遷移率分刊命名為Pg1～Pg7,每種酶原切掉一定數(shù)量的肽段后都可以成為有活性的酶[21];而在鴕鳥的胃中至少有兩種胃蛋白酶;Castillo-Yaňez(2004)也從沙丁魚的胃中分離純化出兩種分子量不同的酸性蛋白酶[9]。從本實驗的結(jié)果推斷金線魚的胃中可能存在兩種以上蛋白酶,這些信息對于進行分離純化實驗是十分有益的。

圖 2 不同體重的金線魚消化道蛋白酶的復(fù)性電泳酶譜

與胃蛋白酶譜帶分布相類似的結(jié)果也可以在其他器官、部位蛋白酶譜帶中發(fā)現(xiàn)。肝胰臟、盲囊、全腸的 I組、II組、III組的蛋白酶譜帶條數(shù)依次為：肝胰臟-2條,4條,5條;盲囊-4條,5條,6條;全腸-5條,6條,6條。而在腸道的前腸、中腸、后腸的 I組、II組、III組的蛋白酶譜帶條數(shù)依次為：前腸-4條,5條,6條;中腸-4條,5條,5條;后腸-4條,5條,5條。肝臟中蛋白酶的亮帶數(shù)量從 I組的兩條,增加到II組、III組的 4條和 5條,使肝胰臟蛋白酶活力急劇上升。從以上結(jié)果可以看出,金線魚消化道各部位蛋白酶隨著體重的增加,其蛋白酶的種類發(fā)生了變化,也在逐漸增多。這是因為魚類孵化后,隨著消化器官的發(fā)育和分化,各種消化酶也開始先后生成。Chong等 (2002)發(fā)現(xiàn)綠盤麗魚從孵化后 3d起,仔魚體內(nèi)就存在絲氨酸蛋白酶這樣的堿性蛋白酶,并且活性明顯加強,其它堿性蛋白酶有金屬蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶等,而有一種絲氨酸蛋白酶,卻在孵化后 20～30d左右才可檢測到[22]。

從前腸、中腸、后腸蛋白酶譜帶 (圖 2b中 1～18泳道)亮帶的寬度比較可以看出,前腸蛋白酶亮帶(圖 2 b中 13～18泳道)的寬度明顯大于中腸 (圖 2b中 7～12泳道)和后腸(圖 2b中 1～6泳道)。

3 結(jié)論

3.1 金線魚的不同消化部位中,單位酶活力從高到低依次為幽門盲囊 ＞胃 ＞前腸 ＞中腸 ＞后腸 ＞肝胰臟,其中最適作用條件下幽門盲囊部位單位的酶活力顯著高于其它消化部位的單位酶活力,但以總活力計算時,仍以胃蛋白酶的總活力最大。

3.2 各消化器官蛋白酶活性均隨實驗魚體重增加而上升,但與體重增加不成比例。不同的部位增長的速度不同,肝臟中蛋白酶活力增長最快,腸道中以前腸蛋白酶活力增長較多。由復(fù)性電泳的結(jié)果表明,不同體重的金線魚的消化道蛋白酶不僅存在活力差異,在種類和數(shù)量上也存在明顯差別。

3.3 以上的結(jié)果可以看出,金線魚消化道蛋白酶復(fù)性電泳的結(jié)果,不僅與活性檢測方法的結(jié)果相一致,而且從蛋白酶的譜帶的條數(shù)和亮帶的區(qū)域大小,可以反映蛋白酶同工酶的種類的多少和活力的大小,更富說服力,且直觀。另一方面,保溫液的 pH和所含的化學(xué)成分可影響蛋白水解酶的活性,因此,通過調(diào)節(jié)保溫液的溫度、pH及保溫時間和在保溫液里加入酶的特異性底物、活化因子或抑制因子等來研究蛋白水解酶的性質(zhì)、功能和鑒定蛋白水解酶的種類。對于這些蛋白酶的生化特性我們將采用其他方法(如雙向復(fù)性電泳等)作進一步的研究。

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Activity distribution of digestive proteases fromNem ipterus Virgatus by non-denatured electrophoresis

ZHUM ei-juan1,TAO Hong2
(1.Guangdong Industry Technical College,Guangzhou 510300,China; 2.College ofLight Industry and Food Sciences,Guangzhou 510641,China)

The d is tribution and p rop e rties of three g roup s of Nem ip te rus virga tus we re s tud ied by non-dena tured e lec trop hores is.The results showed tha t the ac tivities of p rotease in a ll d iges tive organs went up w ith body we ight inc reas ing,but the re was not ra tio be tween the ac tivity and body we ight.Not only the ac tivity but a lso the sp ec ies and am ounts we re d iffe rent w ith the chang ing of body we ight.The p rotease ac tivity was in descend ing orde r, p ylorus caeca＞s tom ach＞foregut＞m idgut＞hindgut＞hep a top anc reas.But m ax im a l tota l p rote lytic ac tivity was found in s tom ach.

Nem ip te rus virga tus(Houttuyn);non-dena tured e lec trop hores is;d iges tive p roteases

TS201.2+5

A

1002-0306(2010)02-0114-05

金線魚 N em ipterus virgatus(Houttuyn)屬鱸形目Percifor m es、金線魚科 N em ipteridae,為暖溫性魚類,棲息于近底層,我國沿海均有分布,以南海分布最多,東海次之,黃海南部偶有捕獲。南海區(qū)以北部灣、珠江口至海陵島近海區(qū)產(chǎn)量較多,漁期全年[1]。金線魚是底拖網(wǎng)作業(yè)的主要捕撈對象之一,也是刺網(wǎng)和釣業(yè)的重要捕撈魚種。僅廣東省茂名市電白縣博賀漁港每天上岸的黃肚金線魚就達幾十噸[2],除一部分鮮食外,大部分被加工成魚糜、魚干、魚露、魚丸等制品,在加工過程中產(chǎn)生大量的內(nèi)臟廢物,引起環(huán)境污染。這些污染物成為限制魚類加工業(yè)發(fā)展的主要問題。所以,尋找一條有效途徑利用這些廢棄物,解決環(huán)境污染問題迫在眉睫。大量研究證明,魚類內(nèi)臟含有豐富的蛋白水解酶,是食品工業(yè)中有效的生化工具。因此,金線魚消化道蛋白酶的回收利用是解決其生產(chǎn)過程中一系列問題的有效辦法。但是,有關(guān)金線魚的研究,僅見黃梓榮和陳作志 (2005)、陳國寶等 (2002)、王雪輝等 (2004)及黃甫 (2006)等對金線魚的生物學(xué)特征如最適捕撈長度、產(chǎn)卵期、資源現(xiàn)狀、魚鱗成分進行了研究[1-5],而其消化道蛋白酶的分布和活性的研究卻鮮有報道。本文主要研究金線魚消化道蛋白酶不同部位的活力分布規(guī)律及不同體重對蛋白酶活力分布的影響,為金線魚消化道蛋白酶的回收、純化及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

2009-04-01

朱美娟(1969-),女,實驗師,研究方向：食品生物技術(shù)。